飼用纖維素酶檢測方法的比較

纖維素酶在飼料工業中得到了廣泛應用，其質量檢測變得越來越重要。纖維素酶是一種復合酶,按作用底物的能力劃分為兩部分,一部分是對棉花纖維素能起催化水解作用的酶,稱為C1酶;另一部分是對羧甲基纖維素鈉(Na-CMC)起水解作用的酶,稱為Cx酶。據此,一般采用兩種測定方法,一種是適用于CX酶的CMC法,另一種是適用于C1酶的濾紙法。下面就此兩種方法作一介紹。1cmc羧甲基纖維法1.1材料表面1.1.1飼料中的纖維素酶由河南省科學院生物研究所提供。1.1.2試劑磷酸氫二鈉、檸檬酸、羧甲基纖維素、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、亞硫酸鈉、苯酚。1.1.3儀器721型分光光度計、恒溫水浴鍋、PHS-2酸度計、秒表。1.1.4試劑的制備1.1.4.酸度測定方法制取0.2mol/L磷酸氫二鈉液(稱取7.16g磷酸氫二鈉溶解于蒸餾水中,定容至100mL)和0.1mol/L的檸檬酸液(稱取2.1g檸檬酸溶解于蒸餾水中,定容至100mL),取磷酸氫二鈉液24.3mL、檸檬酸液25.7mL混勻,用精密酸度計測至pH值為5.0。1.1.4.u3000酸液制備準確稱取2.0g羧甲基纖維素鈉鹽溶于200mL水中,沸水浴中加熱至溶化,過濾,取濾液100mL,加檸檬酸緩沖液20mL、蒸餾水40mL,混勻,貯存于冰箱中備用。1.1.4.酒石酸鉀鈉溶液配制準確稱取6.3g3,5-二硝基水楊酸置于2mol/L氫氧化鈉262mL溶液中,然后加酒石酸鉀鈉的熱溶液(182.0g酒石酸鉀鈉溶于500mL水中),再加5.0g苯酚和5.0g亞硫酸鈉,攪拌至溶解,冷卻后定容至1000mL,貯于棕色瓶中置冰箱中備用。1.1.4.40.1%標準葡萄糖溶液準確稱取經105℃烘至恒重的無水葡萄糖250.000mg,溶于蒸餾水中,定容至250mL。1.2,5-二苯基水楊酸溶液分別吸取0.1%標準葡萄糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,分別定容至50mL。再分別吸取上述溶液各2.5mL于試管中,各加2.5mL3,5-二硝基水楊酸,煮沸5min(另作1管對照,取2.5mL蒸餾水,加2.5mL3,5-二硝基水楊酸,同樣煮沸5min)。冷卻后,用721型分光光度計在530nm波長下比色,記錄各管的光密度值,以光密度作縱座標,對應標準葡萄糖溶液含糖的毫克數為橫座標,繪制標準曲線。1.3,5-二苯基水楊酸5-甲基苯基糖還原糖的制備通過“四分法”精確稱取酶樣品2.00g,加溫水90mL、檸檬酸緩沖液10mL,40℃浸提1h,以脫脂棉過濾備用。根據酶活高低,上述酶液需適當稀釋使其產生的還原糖在100～500μg之間,光密度在0.1～0.6。取1支小試管(15mm×150mm),加羧甲基纖維素鈉溶液2.0mL,于50℃水浴中預熱2～3min,加稀釋酶液0.5mL,保溫30min,取出加入3,5-二硝基水楊酸2.5mL,沸水浴煮沸5min,冷卻后用分光光度計530nm處比色測定OD值。另取小試管加羧甲基纖維素鈉2.0mL,先加入2.5mL3,5-二硝基水楊酸,再加酶液0.5mL,其他操作同樣品測定作空白測定。1.4凈葡萄糖發展CMC酶活力=B×n0.5mg/g?30′?50℃=B×n0.5mg/g?30′?50℃式中:B—從標準曲線中查得的凈葡萄糖毫克數(mg);n—酶液稀釋倍數;0.5—測定時吸取稀釋酶液毫升數(mL)。2過濾紙法2.1材料表面2.1.1濾紙的制備醋酸鈉(AR)、冰醋酸(AR)、甲苯(AR)、氫氧化鈉(AR)、酒石酸鉀鈉(AR)、苯酚(AR)、亞硫酸鈉(AR)、3,5-二硝基水楊酸(AR)、新華5號濾紙(剪成1cm×3cm紙條)。2.1.2儀器同CMC法。2.1.3試劑的制備2.1.3.10.1ol/mlh4.6乙酸-醋酸鈉緩沖液準確稱取醋酸鈉(CH3COONa·3H2O)6.70g和冰醋酸2.60mL,以蒸餾水溶解,定容至1000mL。2.1.3.23、5-二硝酸顯色液配制同CMC法。2.2標準曲線的繪制同CMC法。2.3-二苯基水楊酸解甲基應環氧化法酶液制備同CMC法。樣品測定方法為:準確吸取4mL酶液和1mL緩沖液于試管中,加入新華5號濾紙條一條,滴入甲苯2～3滴防腐,40℃靜止反應24h。吸取濾紙酶解液1mL,加蒸餾水1.5mL、3,5-二硝基水楊酸溶液2.5mL于試管中,沸水浴煮沸5min,冷卻后在530nm處比色測定光密度OD值。吸取4mL蒸餾水代替4mL酶液,其他操作同樣品測定作空白測定。2.4酶活劑濾紙酶活力(FB)=B×n45×1mg/g?24h?40℃(FB)=B×n45×1mg/g?24h?40℃式中:B——從標準曲線上查得的凈葡萄糖毫克數(mg);n——酶液稀釋倍數;45——545——5mL反應液中含4mL酶液;1——吸取1mL酶解液進行測定。3底動產地的酶活力測定作為底物的羧甲基纖維素鈉,用不同廠家