實驗性牙髓炎疼痛信號傳導特點的研究

牙髓炎是最常見的口腔疾病之一。具有強烈的疼痛特點，如冷熱刺激、自發疼痛、夜間疼痛和放療痛。但目前牙痛信號在二級神經元(三叉神經復合體)內的傳導途經仍未明確。Hu等根據神經解剖學和電生理學研究結果提出,三叉神經脊束核是面口部淺感覺信號的中繼核團,尤其三叉神經脊束核尾側亞核(nucleusofthespinaltractofthetrigeminalnerve,caudalpart,sp5c)是面口部痛覺信號傳入的重要驛站;而Takemura等發現,猴牙髓傳入神經在尾側亞核僅有稀少投射,因而認為sp5c甚至整個三叉神經脊束核在牙痛信號傳導中的作用仍有待明確。c-fos基因與疼痛密切相關,是細胞信息傳遞過程中的“核內第三信使”,它能將細胞外短時程的剌激轉換成長時程的細胞效應,研究發現在外周刺激所引起的神經元活動過程中,c-fos基因被激活并表達Fos蛋白,用免疫組織化學方法可檢測Fos蛋白在中樞神經系統(CentralNerveSysten,CNS)內的表達及分布特點,從而可顯示中樞神經系統內的功能通路。本文擬在建立實驗性牙髓炎疼痛模型的基礎上,用免疫組織化學方法檢測腦內Fos免疫陽性神經元(Fos-likeimmunoreactivityneuron,FLN)的分布及規律,以了解牙痛刺激信號在中樞內的傳導途經,初步探討牙痛的中樞傳導機制。1材料和方法1.1動物單次給藥后大鼠的典型誘痛行為空白對照組(A組):9只SD大白鼠,不作任何處理,安靜環境下飼養;牙髓炎誘痛組(B組):45只SD大白鼠,均先建立實驗性牙髓炎模型,封細菌內毒素后24h于乙醚麻醉下用燒熱的充填器反復刺激牙唇面,直到清醒,并觀察其嘶叫情形,誘痛后存活時間與動物數分別為0.5h(9只)、1h(9只)、2h(9只)、4h(9只)、8h(9只);嗎啡注射組(C組):9只SD大白鼠,先建立實驗性牙髓炎誘痛模型,在熱刺激前0.5h腹腔注射嗎啡(10mg/kg),誘痛后存活2h。1.2中性多聚甲醛心臟灌注大大鼠腦立體定位儀各組動物存活至預定時間后行腹腔麻醉,經質量濃度40g/L中性多聚甲醛心臟灌注固定,斷頭,用大鼠腦立體定位儀定位,取塊,恒冷冰凍切片機連續切片,40μm厚,用體積分數3mL/LH2O2接片,待處理。1.3小鼠fos+不同抗菌劑的誘導染色上述切片用LSAB法及GDN(硫酸鎳銨加強染色)法進行漂染。實驗步驟簡述如下:切片用1mL正常羊血清(含3μLTritoneX-100)4℃下孵育0.5h;轉入稀釋度為1∶1000的Fos單抗溶液(SantaCruz),4℃下孵育24h;轉入二抗溶液(生物素標記的抗小鼠IgG),4℃下孵育24h;轉入三抗溶液(辣根過氧化酶標記的鏈霉卵白素復合物),室溫下輕搖2h;DAB法顯色,緩慢加入硫酸鎳銨葡萄糖氧化酶混合液加強染色;裱片;室溫下風干,梯度脫水,透明;封片。實驗中用PBS代替一抗作陰性對照。1.4平均陽性顆粒數核團內神經元細胞核呈棕黑色染色者為陽性細胞;高倍鏡下(×40)在一個核團內隨機選擇5個視野,利用測試網格計算每個視野中的陽性顆粒數,再取5個視野的平均值,則為該核團的平均陽性顆粒數。1.5統計處理q檢驗(Newman-keuls法),檢驗水準雙側α=0.05。2結果2.1誘痛后fln的觀察在牙髓炎癥情況下施予反復熱刺激,實驗鼠CNS內c-fos基因被激活,表現為各核團出現數量不等的FLN(圖1、表1)。從sp5c、孤束核(nucleusofsolitarytract)、室旁核(paraventricularnucleus)、臂旁核(parabrachialnucleus)、大腦皮層(cerebralcortex)這5個有代表性的核團觀察到:誘痛后0.5h,FLN的數量開始增多;1～2hFLN的數量達到高峰;4h后FLN的數量開始減少,直至8hFLN數量又基本恢復至未刺激時的狀態。其余核團也觀察到類似的現象,說明FLN在腦內各核表達的數量呈時間依賴性。2.2fln各核的分布特征2.2.1層內fln的分布空白對照組的sp5c內僅見極少量的FLN分布(5.4±2.8)。牙髓炎疼痛后2h,sp5c的Ⅰ、Ⅱ層背腹側和中間部分可見較為密集的FLN(72.8±9.7,P<0.05),其分布大致呈新月形;在Ⅲ至Ⅴ層見少量的FLN,第Ⅴ層內的FLN細胞體較大(圖1A);對側亦可見少量的FLN,主要在中間部。誘痛后應用嗎啡,相應核團FLN數量明顯減少,與空白對照組相近(7.3±2.5,P>0.05)。2.2.2局部至中等量的fln牙髓炎誘痛后2h,感覺主核(principalsensorynucleus)、口核(oralis)、極間核(interpolaris)(圖1B)可見少量至中等量的FLN出現(見表1),誘痛后使用嗎啡能抑制這些核團的FLN的出現。2.2.3para-n的誘導表達牙髓炎誘痛后2h,藍斑(locusceruleus)、孤束核(nucleusofsolitary)、臂旁核(parabrachialnucleus,圖1C)、中腦導水管周圍灰質(peripherygrayofcentralcanal)、室旁核(paraventricularnucleus)及大腦軀體感覺皮質(cerebralcortex,圖1D)等均可見中等量至大量的FLN(見表1),以同側為主,誘痛后使用嗎啡使明顯抑制上述核團的FLN。3叉神經磺束神經同體尾側亞核和其它亞核的樞紐傳導和調節三叉神經系統的痛刺激從外周向中樞傳導的過程經過第一級雙極神經元,第二級三叉神經感覺核簇,第三級丘腦腹后區神經元后到達大腦皮質的軀體感覺區,產生了痛覺。本研究發現,在二級傳導通路核團上,FLN主要出現在sp5c的第Ⅰ、Ⅱ層,少量出現在第Ⅴ層。Takemura等觀察到痛傳入神經纖維主要終止在尾側亞核的Ⅰ、Ⅱ層;尾側亞核Ⅰ、Ⅱ層是痛感受神經元的分布區,第Ⅲ、Ⅳ層主要是非傷害性神經元的分布區,提示尾側亞核與頭面部的初級傳入尤其是痛(傷害性刺激)傳入有密切聯系。因此,本實驗結果對sp5c尤其是第Ⅱ層在牙痛痛覺的傳導和調節中所起的關鍵作用,提供了形態學的證據。本實驗進一步觀察到:FLN陽性顆粒主要密集分布在尾側亞核,而且極間核、口核和感覺主核同樣可見到FLN的分布。以前的研究結果認為三叉神經腦干復合體中只有尾側亞核參與了牙痛信息的中樞傳導,極間核、口核、感覺主核等其它的亞核并未在牙痛中起作用。本實驗與既往的研究結果不同,其原因可能是由于實驗中采用的動物模型、刺激的類型及誘導的疼痛的強度不同所致。例如在實驗過程中我們觀察到大鼠對熱刺激誘發的牙髓炎疼痛反應較為劇烈,出現嘶叫、呼吸急促、煩燥等軀體反應,這可能是因為本實驗誘發的疼痛程度較強,誘發了極間核、口核、感覺主核內的痛感受神經元的反應。據此,我們認為除了尾側亞核外,三叉神經脊束核的其他亞核亦參與了牙痛信息的中樞傳導和調節。本研究還發現Fos蛋白在孤束核、藍斑、臂旁核、室旁核、中央杏仁核、中腦導水管周圍灰質等非特異性核團內也有表達。但實驗中未能發現丘腦腹后內側核核團內有FLN陽性顆粒的出現,而在大腦皮質層軀體感覺區卻有FLN的出現。這一結果與丘腦的腹后內側核是三叉神經傷害性刺激向大腦皮質層投射的中繼核的傳統觀點有差異,這提示傳導痛覺的Fos樣神經元由二級傳入后可能并未中轉于腹后內側核,而是通過其它的核團,如臂旁核等投射到感覺皮層,即可能通過c-f