氨基酸與神經元鈣離子內流的關系

谷氨酸是腦組織中的主要興奮性氨基酸。在某些情況下，它也對神經元有毒性作用。有學者認為,興奮性毒性是腦卒中、低血糖、癲癇、Huntington病和Alzheimer病的發病機制。谷氨酸及其化合物所致的神經元損害可能是由于過度刺激受體的結果,而鈣離子在這個過程中起關鍵作用,細胞內鈣離子超載介導N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體過度刺激引起細胞死亡。雖然已提出鈣離子和鈉離子內流增加、自由基的產生、代謝酶的破壞、細胞膜衰竭及細胞骨架的破壞等學說,但興奮性氨基酸引起的神經細胞死亡的機制仍不清楚。早期研究認為,興奮性毒性導致的細胞死亡的形式是壞死。然而,近來研究結果證明,有些細胞死亡實際上是凋亡。細胞死亡的模式決定于損傷的程度。這種不一致性可能是由于同時存在壞死和凋亡。我們用新生大鼠原代培養的皮質神經元、激光共聚焦顯微鏡、Fluo-3熒光染色、TUNEL法等技術重點研究谷氨酸處理后,單個神經元早期細胞內鈣離子變化和形態改變及谷氨酸受體拮抗劑MK-801的保護作用。1材料和方法1.1帶模抗凝劑的nbt和bcip底物程序性細胞死亡檢測試劑盒(德國Boehringer公司):試劑盒包括TdT酶、含生物素化duTP緩沖液,含NBT和BCIP底物的顯色液、含鏈親合素化的堿性磷酸酶(HRP-streptavidin)的反應液等;Fluo-3-AM、TritonX-100、L-谷氨酸、MK-801(美國Sigma公司);HEPES(德國Boehringer公司);DMEM培養液(美國Gibco-BRL公司)。1.2免疫組化染色取出生1~2d的Wistar大鼠(二級),在無菌條件下斷頭、取腦,分離出雙側皮質,置于0.125%胰蛋白酶消化液中,在37℃、5%CO2條件下孵育30min,用細口徑滴管吹打數次,以種植培養液稀釋成5×106個細胞/ml密度,接種于涂有多聚賴氨酸(50mg/L)的96孔板和含蓋玻片的(18mm×18mm)玻璃培養皿(直徑35mm,2ml/每皿)中,置標本于37℃、5%CO2培養箱中。細胞培養液含80%DMEM培養液、10%馬血清、10%胎牛血清、葡萄糖6g/L、芐基青霉素100kU/L和鏈霉素100mg/L。接種第3天,在血清培養液中加入細胞分裂抑制劑阿糖胞苷(10μmol/L)以抑制非神經細胞的過度增殖。48h后更換新鮮飼養液。以后每周換液2次,每次更換一半新鮮飼養培養液。用NSE單克隆抗體免疫組化染色證明細胞是神經元。培養第9天開始做谷氨酸實驗。1.3檢測陽性總黃樹莓原汁和總黃汁的表達原位凋亡細胞的檢測用TUNEL技術稍做改動。在蓋玻片上培養的神經細胞用4%多聚甲醛在4℃固定2h,用10mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)沖洗,加入20mg/L蛋白酶K,室溫30min,PBS洗5min,加入0.3%H2O2(甲醇溶解),PBS洗2次,加0.1%TritonX-100(0.1%醋酸鈉配制),冰浴2min,PBS洗2次,涼干,加TUNEL反應液(1μlTdT+9μl含Biotin-dUTP緩沖液),置濕盒中,37℃,60min(陰性對照組不加酶);加入顯色液,置于暗盒中60min,0.5%甲基綠復染20s,二甲苯透明,明膠封片,顯微鏡下觀察有藍紫色顆粒者為陽性。在顯微鏡下記數凋亡細胞。1.4細胞內fluo-3的動態熒光強度檢測激光共聚焦顯微鏡(美國Meridian公司)培養的細胞用含AM的Fluo-3(10μmol/L)在室溫(26℃)染色2h。用含鈣、鎂的PBS洗3次后,將96孔培養板放入激光共聚焦顯微鏡掃描平臺。在40倍長工作距離的物鏡下動態觀察Fluo-3指示鈣離子的變化。在時間序列程序下,開始預掃描。在對照的圖像確定后,立即用微量加樣器將少量1mmol/L谷氨酸加入培養孔中,神經元的熒光圖像每4s記錄1次,共250s,并繪制出細胞內Fluo-3的熒光強度在加藥后隨時間變化的曲線。在保護實驗中,MK-801(10μmol/L)在用谷氨酸之前5min加入。2結果2.1大力合成陽性細胞在對照組中,可觀察到少數染色陽性的細胞,與用相似方法培養的神經元中持續少量細胞死亡一致。培養神經元在1mmol/L谷氨酸處理后24h,染色陽性的細胞與非凋亡細胞相比,在顯微鏡下可見濃縮和核裂解,(56±3)%(計15個視野)表現為染色陽性的細胞。預先用10μmol/LMK-801后,染色陽性的細胞為(11±1)%(共進行4批實驗,P<0.05)。2.2氨酸對fluo-3表達的影響用Fluo-3染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察鈣離子濃度。當加入1mmol/L谷氨酸時,80%以上的細胞(觀察30個視野)顯示Fluo-3的熒光強度增加,經校正后繪制熒光強度的時間曲線向上,說明鈣離子增加。盡管谷氨酸持續存在,但信號強度在數分鐘內減弱。在這個反應中,MK-801完全阻斷Fluo-3這種熒光強度的增加。3種受體抗劑的抑菌作用在本研究中,我們用原位末端標記法,在谷氨酸處理后24h可見大多數聚集在一起的死亡細胞表現為凋亡樣形態,由于MK-801能明顯地減少這些染色陽性的凋亡細胞,因此,這種由谷氨酸誘導的細胞凋亡很可能是通過谷氨酸受體介導的。應用共聚焦顯微鏡,我們檢測到谷氨酸誘導神經元內的鈣濃度快速增加,細胞質和細胞核內的鈣離子都增加。這種反應可被MK-801抑制,表明鈣離子的增加依賴細胞外離子的存在,說明由谷氨酸誘導的鈣離子增加可激活核酸內切酶,導致神經元內DNA斷裂。本研究結果顯示,谷氨酸對神經元有興奮性毒性,與以往的研究結果一致,雖然興奮性毒性的濃度、處理的時間及神經元的成熟等會影響神經元變性的最大程度。然而,NMDA受體在興奮性毒性細胞死亡過程中可能起重要作用,因為這種受體拮抗劑如AP-5和MK-801等能預防谷氨酸毒性。在我們的實驗中,MK-801還抑制谷氨酸介導的細胞內游離鈣離子信號。凋亡,也稱程序性細胞死亡,具有特征性形態學改變,凋亡的特征是染色質致密和核皺縮;壞死是快速的細胞和細胞器腫脹。有證據表明,有些興奮性毒性是凋亡過程,這與以前認為興奮性毒性死亡只通過壞死的機制的觀點不符。有研究結果表明,在皮質、紋狀體及海馬神經元的興奮性毒性可能導致壞死和凋亡。在皮質神經元培養中,細胞死亡的形式由刺激的程度決定(輕度是凋亡,重度是壞死)。我們的研究結果顯示,用原位TUNEL法顯示,體外培養的大鼠皮質神經元用谷氨酸刺激后24h,細胞死亡主要表現為凋亡的形態特征,與以往描述的遲發性凋亡相似,MK-801能預防谷氨酸的這種損害。我們通過測定培養神經元中谷氨酸刺激后細胞內鈣離子水平來了解這種保護作用的機制。興奮性氨基酸介導細胞內鈣離子水平超過某個域值后,在神經細胞死亡中起重要作用。但是鈣離子進入細胞內的機制對神經元的毒性起重要作用,通過谷氨酸受體進入細胞導致死亡,而K+或氰化物也可使鈣離子濃度增加,卻對神經元無毒性。谷氨酸所致鈣離子內流的機制很復雜,包括通過NMDA受體離子通道和細胞內鈣離子重分配。通過NMDA受體通道、細胞內鈣離子釋放或細胞內鈣螯合物等阻止鈣進入細胞內,可防止興奮性氨基酸介導的細胞死亡。雖然NMDA受體激活不是通過電壓-門依賴鈣通道引起鈣內流,但有些證據表明,阻止電壓-門依賴鈣通道也能預防神經細胞死亡,同時,在海馬神經元和小腦顆粒細胞也有類似的現象。研究結果表明,鈣離子通道阻滯劑尼群地平不能減少谷氨酸介導的鈣離子升高。導致神經元死亡的鈣離子升高的機制和來源還不完全清楚,因此,不能明確谷氨酸刺激鈣信號的單個成分,這樣只能預防存在于NMDA受體和(或)與鈣離子庫釋放或鈣平衡有關的細胞內部分等敏感部分,他們都能減少細胞內鈣負荷。Wood等報道,神經保護和NMDA受體失敏感