氨基酸與神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流的關(guān)系

谷氨酸是腦組織中的主要興奮性氨基酸。在某些情況下，它也對(duì)神經(jīng)元有毒性作用。有學(xué)者認(rèn)為,興奮性毒性是腦卒中、低血糖、癲癇、Huntington病和Alzheimer病的發(fā)病機(jī)制。谷氨酸及其化合物所致的神經(jīng)元損害可能是由于過(guò)度刺激受體的結(jié)果,而鈣離子在這個(gè)過(guò)程中起關(guān)鍵作用,細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載介導(dǎo)N-甲基-D-門冬氨酸(NMDA)受體過(guò)度刺激引起細(xì)胞死亡。雖然已提出鈣離子和鈉離子內(nèi)流增加、自由基的產(chǎn)生、代謝酶的破壞、細(xì)胞膜衰竭及細(xì)胞骨架的破壞等學(xué)說(shuō),但興奮性氨基酸引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡的機(jī)制仍不清楚。早期研究認(rèn)為,興奮性毒性導(dǎo)致的細(xì)胞死亡的形式是壞死。然而,近來(lái)研究結(jié)果證明,有些細(xì)胞死亡實(shí)際上是凋亡。細(xì)胞死亡的模式?jīng)Q定于損傷的程度。這種不一致性可能是由于同時(shí)存在壞死和凋亡。我們用新生大鼠原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元、激光共聚焦顯微鏡、Fluo-3熒光染色、TUNEL法等技術(shù)重點(diǎn)研究谷氨酸處理后,單個(gè)神經(jīng)元早期細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化和形態(tài)改變及谷氨酸受體拮抗劑MK-801的保護(hù)作用。1材料和方法1.1帶模抗凝劑的nbt和bcip底物程序性細(xì)胞死亡檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Boehringer公司):試劑盒包括TdT酶、含生物素化duTP緩沖液,含NBT和BCIP底物的顯色液、含鏈親合素化的堿性磷酸酶(HRP-streptavidin)的反應(yīng)液等;Fluo-3-AM、TritonX-100、L-谷氨酸、MK-801(美國(guó)Sigma公司);HEPES(德國(guó)Boehringer公司);DMEM培養(yǎng)液(美國(guó)Gibco-BRL公司)。1.2免疫組化染色取出生1~2d的Wistar大鼠(二級(jí)),在無(wú)菌條件下斷頭、取腦,分離出雙側(cè)皮質(zhì),置于0.125%胰蛋白酶消化液中,在37℃、5%CO2條件下孵育30min,用細(xì)口徑滴管吹打數(shù)次,以種植培養(yǎng)液稀釋成5×106個(gè)細(xì)胞/ml密度,接種于涂有多聚賴氨酸(50mg/L)的96孔板和含蓋玻片的(18mm×18mm)玻璃培養(yǎng)皿(直徑35mm,2ml/每皿)中,置標(biāo)本于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞培養(yǎng)液含80%DMEM培養(yǎng)液、10%馬血清、10%胎牛血清、葡萄糖6g/L、芐基青霉素100kU/L和鏈霉素100mg/L。接種第3天,在血清培養(yǎng)液中加入細(xì)胞分裂抑制劑阿糖胞苷(10μmol/L)以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度增殖。48h后更換新鮮飼養(yǎng)液。以后每周換液2次,每次更換一半新鮮飼養(yǎng)培養(yǎng)液。用NSE單克隆抗體免疫組化染色證明細(xì)胞是神經(jīng)元。培養(yǎng)第9天開始做谷氨酸實(shí)驗(yàn)。1.3檢測(cè)陽(yáng)性總黃樹莓原汁和總黃汁的表達(dá)原位凋亡細(xì)胞的檢測(cè)用TUNEL技術(shù)稍做改動(dòng)。在蓋玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞用4%多聚甲醛在4℃固定2h,用10mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)沖洗,加入20mg/L蛋白酶K,室溫30min,PBS洗5min,加入0.3%H2O2(甲醇溶解),PBS洗2次,加0.1%TritonX-100(0.1%醋酸鈉配制),冰浴2min,PBS洗2次,涼干,加TUNEL反應(yīng)液(1μlTdT+9μl含Biotin-dUTP緩沖液),置濕盒中,37℃,60min(陰性對(duì)照組不加酶);加入顯色液,置于暗盒中60min,0.5%甲基綠復(fù)染20s,二甲苯透明,明膠封片,顯微鏡下觀察有藍(lán)紫色顆粒者為陽(yáng)性。在顯微鏡下記數(shù)凋亡細(xì)胞。1.4細(xì)胞內(nèi)fluo-3的動(dòng)態(tài)熒光強(qiáng)度檢測(cè)激光共聚焦顯微鏡(美國(guó)Meridian公司)培養(yǎng)的細(xì)胞用含AM的Fluo-3(10μmol/L)在室溫(26℃)染色2h。用含鈣、鎂的PBS洗3次后,將96孔培養(yǎng)板放入激光共聚焦顯微鏡掃描平臺(tái)。在40倍長(zhǎng)工作距離的物鏡下動(dòng)態(tài)觀察Fluo-3指示鈣離子的變化。在時(shí)間序列程序下,開始預(yù)掃描。在對(duì)照的圖像確定后,立即用微量加樣器將少量1mmol/L谷氨酸加入培養(yǎng)孔中,神經(jīng)元的熒光圖像每4s記錄1次,共250s,并繪制出細(xì)胞內(nèi)Fluo-3的熒光強(qiáng)度在加藥后隨時(shí)間變化的曲線。在保護(hù)實(shí)驗(yàn)中,MK-801(10μmol/L)在用谷氨酸之前5min加入。2結(jié)果2.1大力合成陽(yáng)性細(xì)胞在對(duì)照組中,可觀察到少數(shù)染色陽(yáng)性的細(xì)胞,與用相似方法培養(yǎng)的神經(jīng)元中持續(xù)少量細(xì)胞死亡一致。培養(yǎng)神經(jīng)元在1mmol/L谷氨酸處理后24h,染色陽(yáng)性的細(xì)胞與非凋亡細(xì)胞相比,在顯微鏡下可見濃縮和核裂解,(56±3)%(計(jì)15個(gè)視野)表現(xiàn)為染色陽(yáng)性的細(xì)胞。預(yù)先用10μmol/LMK-801后,染色陽(yáng)性的細(xì)胞為(11±1)%(共進(jìn)行4批實(shí)驗(yàn),P<0.05)。2.2氨酸對(duì)fluo-3表達(dá)的影響用Fluo-3染色后用激光共聚焦顯微鏡觀察鈣離子濃度。當(dāng)加入1mmol/L谷氨酸時(shí),80%以上的細(xì)胞(觀察30個(gè)視野)顯示Fluo-3的熒光強(qiáng)度增加,經(jīng)校正后繪制熒光強(qiáng)度的時(shí)間曲線向上,說(shuō)明鈣離子增加。盡管谷氨酸持續(xù)存在,但信號(hào)強(qiáng)度在數(shù)分鐘內(nèi)減弱。在這個(gè)反應(yīng)中,MK-801完全阻斷Fluo-3這種熒光強(qiáng)度的增加。3種受體抗劑的抑菌作用在本研究中,我們用原位末端標(biāo)記法,在谷氨酸處理后24h可見大多數(shù)聚集在一起的死亡細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡樣形態(tài),由于MK-801能明顯地減少這些染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞,因此,這種由谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡很可能是通過(guò)谷氨酸受體介導(dǎo)的。應(yīng)用共聚焦顯微鏡,我們檢測(cè)到谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元內(nèi)的鈣濃度快速增加,細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的鈣離子都增加。這種反應(yīng)可被MK-801抑制,表明鈣離子的增加依賴細(xì)胞外離子的存在,說(shuō)明由谷氨酸誘導(dǎo)的鈣離子增加可激活核酸內(nèi)切酶,導(dǎo)致神經(jīng)元內(nèi)DNA斷裂。本研究結(jié)果顯示,谷氨酸對(duì)神經(jīng)元有興奮性毒性,與以往的研究結(jié)果一致,雖然興奮性毒性的濃度、處理的時(shí)間及神經(jīng)元的成熟等會(huì)影響神經(jīng)元變性的最大程度。然而,NMDA受體在興奮性毒性細(xì)胞死亡過(guò)程中可能起重要作用,因?yàn)檫@種受體拮抗劑如AP-5和MK-801等能預(yù)防谷氨酸毒性。在我們的實(shí)驗(yàn)中,MK-801還抑制谷氨酸介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子信號(hào)。凋亡,也稱程序性細(xì)胞死亡,具有特征性形態(tài)學(xué)改變,凋亡的特征是染色質(zhì)致密和核皺縮;壞死是快速的細(xì)胞和細(xì)胞器腫脹。有證據(jù)表明,有些興奮性毒性是凋亡過(guò)程,這與以前認(rèn)為興奮性毒性死亡只通過(guò)壞死的機(jī)制的觀點(diǎn)不符。有研究結(jié)果表明,在皮質(zhì)、紋狀體及海馬神經(jīng)元的興奮性毒性可能導(dǎo)致壞死和凋亡。在皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)中,細(xì)胞死亡的形式由刺激的程度決定(輕度是凋亡,重度是壞死)。我們的研究結(jié)果顯示,用原位TUNEL法顯示,體外培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元用谷氨酸刺激后24h,細(xì)胞死亡主要表現(xiàn)為凋亡的形態(tài)特征,與以往描述的遲發(fā)性凋亡相似,MK-801能預(yù)防谷氨酸的這種損害。我們通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)神經(jīng)元中谷氨酸刺激后細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平來(lái)了解這種保護(hù)作用的機(jī)制。興奮性氨基酸介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平超過(guò)某個(gè)域值后,在神經(jīng)細(xì)胞死亡中起重要作用。但是鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制對(duì)神經(jīng)元的毒性起重要作用,通過(guò)谷氨酸受體進(jìn)入細(xì)胞導(dǎo)致死亡,而K+或氰化物也可使鈣離子濃度增加,卻對(duì)神經(jīng)元無(wú)毒性。谷氨酸所致鈣離子內(nèi)流的機(jī)制很復(fù)雜,包括通過(guò)NMDA受體離子通道和細(xì)胞內(nèi)鈣離子重分配。通過(guò)NMDA受體通道、細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放或細(xì)胞內(nèi)鈣螯合物等阻止鈣進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),可防止興奮性氨基酸介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。雖然NMDA受體激活不是通過(guò)電壓-門依賴鈣通道引起鈣內(nèi)流,但有些證據(jù)表明,阻止電壓-門依賴鈣通道也能預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞死亡,同時(shí),在海馬神經(jīng)元和小腦顆粒細(xì)胞也有類似的現(xiàn)象。研究結(jié)果表明,鈣離子通道阻滯劑尼群地平不能減少谷氨酸介導(dǎo)的鈣離子升高。導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的鈣離子升高的機(jī)制和來(lái)源還不完全清楚,因此,不能明確谷氨酸刺激鈣信號(hào)的單個(gè)成分,這樣只能預(yù)防存在于NMDA受體和(或)與鈣離子庫(kù)釋放或鈣平衡有關(guān)的細(xì)胞內(nèi)部分等敏感部分,他們都能減少細(xì)胞內(nèi)鈣負(fù)荷。Wood等報(bào)道,神經(jīng)保護(hù)和NMDA受體失敏感