中樞神經系統(tǒng)中ca

鈣是細胞中的一個重要信號分子，參與了許多重要細胞過程的控制。在生物進化過程中，真核細胞形成了一個復雜的ca2雙向系統(tǒng)，包括離子通道、離子泵和離子交換體，以維持細胞中的鈣2。如果細胞中ca2濃度（ca2）i的突然變化，許多細胞中的信號事件可能會觸發(fā)。這些對于正常細胞活動和細胞功能的病理變化非常重要。大多數(shù)由含有ca2的細胞過程組成的糖蜜。在許多ca2+結合蛋白質中，鈣調素（cm）是最重要的。它廣泛存在于不同的真核細胞中，它們參與了許多生物功能，如肌肉收縮、觸覺傳遞、神經變化和釋放、激素分泌和基因表達。大量研究表明，ca2+cm參與離子通道和受體的功能調節(jié)。1ca2+/ca2+/cdkca2+/ca2的種自調控作用電壓依賴性Ca2+通道介導的Ca2+內流參與許多細胞內信號傳導過程,其中對通道自身活動的調控就是一種重要的形式.這種自調控包括使通道開放減少的失活作用(inactivation)和使通道開放增強的易化作用(facilitation).這兩種類型的自調控對細胞重復活動時的Ca2+流量及其下游活動都有十分重要的影響.許多試驗[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20]證明:Ca2+/CaM介導了電壓依賴性Ca2+通道的失活和易化.1.1l型ca2+通道的ca2+依賴性失活和易化早在20年前,Brehm等就報道了一個奇怪的現(xiàn)象:電壓依賴性的Ca2+通道不僅可以被去極化打開,也可因持續(xù)的去極化而失活,這種失活是Ca2+依賴性的,即Ca2+通道打開引起Ca2+內流,內流的Ca2+反過來引起Ca2+通道的失活(圖1).近年來,人們還注意到Ca2+也參與Ca2+通道的易化,在許多類型的電壓依賴性Ca2+通道中,L型Ca2+通道的失活和易化現(xiàn)象尤為明顯.由于經L型Ca2+通道介導的Ca2+內流,可以觸發(fā)心肌收縮,控制分泌細胞的激素分泌,調控神經元基因表達和觸發(fā)與學習記憶相關的轉錄過程,因而,L型Ca2+通道的Ca2+依賴性失活和易化等自調控作用具有重要的生物學意義.最近對L型Ca2+通道失活和易化的分子機制研究發(fā)現(xiàn),CaM作為普遍存在的Ca2+感受器,在L型Ca2+通道的Ca2+依賴性失活和易化中起主要作用.Ziihlke等及Peterson等分別發(fā)現(xiàn)L型Ca2+通道的α1C亞基的C末端結構域中有一個可結合Ca2+/CaM的IQmotif(isoleucine-glutamine,1624Ile～Leu1635)(圖2),是它介導了L,型Ca2+通道的Ca2+依賴性失活和易化.Zühlke等證明,L型Ca2+通道的調控依賴于IQmotif內的一些氨基酸殘基.當IQmotif內C末端第1624位的異亮氨酸(lle)突變?yōu)楸彼?Ala)時,可消除通道的Ca2+依賴性失活,而使通道在連續(xù)激活時呈現(xiàn)強烈的Ca2+依賴性易化現(xiàn)象;而當?shù)?624位的Ile突變?yōu)楣劝彼?Glu)時,Ca2+依賴性失活和易化現(xiàn)象都消失(圖2).他們還發(fā)現(xiàn),L型Ca2+通道的Ca2+依賴性失活和易化都依賴于正常的CaM與IQmotif的結合.當CaM(從N端到C端有4個EFhand)中的任意3個EFhand的門冬氨酸(Asβ)突變?yōu)锳la時,也可消除通道的Ca2+依賴性失活和易化.所以,不論是α1c亞基IQmotif內C末端第1624位的Ile突變防礙IQmotif對Ca2+/CaM的結合,還是CaM的突變降低CaM對Ca2+的親和力,都可抑制L型Ca2+通道的Ca2+依賴性失活和易化,可見,L型Ca2+通道的失活和易化是α1C亞基的IQmotif與Ca2+/CaM相互作用的結果,任何一方結構和功能的改變都影響通道的特性(圖3).這些結果也顯示Ca2+/CaM對通道的調控可以是正性的,也可以是負性的.但是,Ca2+/CaM的真正作用位點仍存在爭議,它可能直接結合于通道的孔區(qū)形成亞基α1C亞基(圖2,3),或作用于其他目標,如蛋白激酶或磷酸酶,從而調控Ca2+通道的活性.Lee等和Peterson等發(fā)現(xiàn),Ca2+/CaM除了結合到α1c亞基C末端的IQmotif外,還可結合到第2個結合位點——EFhand結構域(圖3),從而產生較弱的Ca2+依賴性失活;Ca2+/CaM結合到第2個結構域對長時程的Ca2+依賴性易化也是必要的.最近,Peterson等證明,盡管CaM在L型Ca2+通道的Ca2+依賴性失活中擔當Ca2+感受器的作用,但是在Ca2+/CaM的結合和通道失活之間起橋梁作用的卻是α1c亞基的C末端的EFhand結構域.1.2ca2+通道與1c亞基的關系在許多突觸中,神經遞質的釋放依賴于P/Q,N和R型Ca2+通道介導的Ca2+內流.由于神經遞質的釋放與Ca2+濃度的四次方成比例,所以通過這些Ca2+通道內流的Ca2+能極大地影響神經信號傳遞.Ca2+/CaM除了對L型Ca2+通道有調控作用外,對神經元中的P/Q,N和R型Ca2+通道也有影響,這表明Ca2+/CaM在Ca2+通道家族中有廣泛的調控作用。據(jù)Lee等和Peterson等報道,P/Q和R型Ca2+通道的孔形成亞基分別為α1A亞基和α1E亞基,它們的C末端也都有IQ樣motif,并且IQ樣motif以Ca2+依賴性方式與CaM結合,但是P/Q和R型Ca2+通道并不表現(xiàn)Ca2+依賴性的失活,說明Ca2+/CaM與α1A亞基和α1E亞基的IQ樣motif的結合可能另有其他重要功能.在P/Q型Ca2+通道的α1A亞基的C末端IQ樣motif的下游還有一個由32個氨基酸殘基構成的Ca2+/CaM結合結構域,其氨基酸序列與腺苷環(huán)化酶8(AC8)有高度的同源性.此結構域的功能與L型Ca2+通道的第2個結合位點一樣,Ca2+/CaM與其結合會使P/Q型Ca2+通道產生較弱的Ca2+依賴性的失活和長時程的Ca2+依賴性易化.這些結果進一步說明,電壓依賴性Ca2+通道具有不止一個Ca2+/CaM結合位點,Ca2+/CaM與不同位點結合時會產生不同的效應.Lee等的實驗結果支持了一個模型:經P/Q型Ca2+通道內流的Ca2+促進了Ca2+/CaM與α1A亞基的第2個Ca2+/CaM結合位點的結合,從而加速通道的失活,并促進通道從失活狀態(tài)中恢復,產生長時程的Ca2+電流易化,進而增加Ca2+內流,以至于通道從失活狀態(tài)完全恢復后Ca2+電流比原先還大.這是一種較慢的調控方式,它可使細胞在一系列連續(xù)刺激時積聚大量量的Ca2+,Ca2+的積聚加快了P/Q型通道的失活,縮短了Ca2+瞬態(tài),促進Ca2+信號的終止.總的結果是使具有P/Q型Ca2+通道的樹突和神經末梢的Ca2+信號更快、更強.總之,目前的研究認為,在電壓依賴性L型Ca2+通道中,經通道內流的Ca2+可結合到通道孔形成亞基——α1c亞基的IQmotif而引起通道反饋性的Ca2+依賴性失活和易化,其中CaM是真正的Ca2+感受器,其可能的機理是:結合在通道孔形成亞基的CaM和內流的Ca2+結合,Ca2+/CaM與構成通道孔區(qū)的α1C亞基的IQ樣motif相互作用,進而引起Ca2+依賴性失活和易化(圖3).由于Ca2+螯合劑很難抑制Ca2+依賴性的失活,說明引起失活的Ca2+/CaM結合位點離通道孔很近.而在P/Q,N和R型Ca2+通道中,IQ樣motif的作用尚不清楚,通道的Ca2+依賴性失活和易化有賴于Ca2+/CaM與通道的第2個結合位點的結合.2gln-met-gln-leu650的結構分析NMDAR是由NR1亞基和NR2亞基構成的復合體,它在哺乳動物中樞神經系統(tǒng)(CNS)的突觸傳遞、突觸可塑性、突觸形成和興奮性毒性細胞死亡等現(xiàn)象中起關鍵作用.NMDAR的一個主要特性是它對Ca2+有很高的通透性.Ehlers,Zhang等,Krupp等以及我們的工作證明,NMDAR介導的Ca2+內流可導致NMDAR的開放頻率降低,加速通道的失活,這種Ca2+依賴性的失活可反饋性地調控NMDAR介導的Ca2+內流(圖4).最近的分子生物學研究顯示,在NR1亞基中的C末端有3個結構域,從C末端起分別稱為C2,C1和C0.在C0和C1結構域中分別有一個Ca2+/CaM結合位點:CBS(CaMbindingsite)1(Lys839～Gln863)和CBS2(Lys875～Lys898)(圖5).當CBS1中的一段氨基酸序列847Gln-Met-Gln-Leu850突變?yōu)?個Ala時,只輕微地降低CaM與C0結構域的親和力;而突變?yōu)?個Glu時,則完全阻止CaM對C0結構域的結合,從而阻止NMDAR的Ca2+依賴性失活,而且,當細胞內灌注CaM抑制肽時也可明顯抑制NMDAR的Ca2+依賴性失活.這說明Ca2+/CaM是結合到NR1亞基的CO結構域而調控NMDAR的Ca2+依賴性失活的,隨后的研究進一步揭示,NMDAR的失活還涉及NR1亞基的另一個結合伙伴-—肌動蛋白結合蛋白α-actinin(如α-actinin2).通常情況下,NR1亞基通過C末端與α-actinin2結合而錨靠在肌動蛋白細胞骨架上,當NMDAR被激活時,Ca2+內流激活CaM,Ca2+/CaM競爭α-actinin2對NR1亞基C0區(qū)的結合,結果導致C0區(qū)從肌動蛋白細胞骨架上解離,使NR1亞基的C末端游離(圖6).游離的C末端進一步引起NMDAR的結構變化或直接與NMDAR的其他部位作用,從而降低通道的開放概率,導致通道的Ca2+依賴性失活.至于NMDAR中C1結構域中的CBS2的功能,至今還不太清楚,它可能參與調控NR1的定位.最近研究還發(fā)現(xiàn),NR2亞基在NMDAR的Ca2+依賴性失活中也起一定的作用,它可能參與調控CaM與C0結構域的結合,或與NR1亞基C末端以Ca2+依賴性方式相互作用.3k+通道亞家族鈣激活的K+通道(KCa)是一種Ca2+依賴性的K+通道,它受電壓和Ca2+雙重門控,可因去極化和[Ca2+]i升高而激活,根據(jù)電導大小,Kca又可分為SK(smallconductance),IK(intermediateconductance)和BK(largeconductance)3種.SK介導動作電位(AP)之后的慢后超級化(sAHP),并借此調控神經元AP的發(fā)放頻率,同時,它對正常的神經傳遞也是必要的,并在調控神經元興奮性中起基礎性作用.對SK通道家族已知的3個成員SK1,SK2,SK3的分析表明,它們的氨基酸序列具有高度的同源性,但與其他類型的K+通道亞家族的同源性卻很低.現(xiàn)已證明,SK通道是電壓非依賴性的、高親和力的Ca2+感受器,可被胞內低于微摩爾濃度的Ca2+激活,從而使胞內Ca2+濃度的變化轉換為膜電位的變化.SK通道的激活不是由于Ca2+直接結合到形成通道的α亞基上引起的,而與CaM有關.SK的α亞基胞漿側C末端有4個重復序列(S7,S8,S9,S10),它們形成一個“殼”(shell),CaM就緊密地結合在里面,這種結合是Ca2+非依賴性的.CaM甚至可以看作是SK通道的β亞基,功能性的SK通道是SK與CaM結合而成的異聚體.Xia等利用酵母雙雜交分析和生化技術顯示,CaM的第3,4EFhand中的Asp突變?yōu)锳la(DEF3,4A),或第2,3,4EFhand中的Asp突變?yōu)锳la(DEF2,3,4A)或第1,2,3,4EFhand中的Asp突變?yōu)锳la(DEF1,2,3,4A)時,都會使CaM對Ca2+的親和力有所降低,當這些突變型CaM與SK通道共表達時,通道的Ca2+敏感性明顯降低,這說明CaM參與SK通道的調控,同時他們還證明,SK通道的激活是由于Ca2+結合到CaM上引起CaM的結構變化,隨后引起SK通道α亞基結構的變化,進而導致其Ca2+依賴性門控。最近,在包括造血細胞在內的非神經細胞的IK,BK家族中也有與SK通道調控很相似的報道:CaM可以結合到IK通道上而調控通道的功能,突變型CaM對IK通道電流則產生強烈的抑制效應.BK通道的孔區(qū)形成亞基——α亞基的C末端有一個被稱為“calciumbowl”的結構域,它含有許多酸性氨基酸殘基,尤其是Asp,并且在不同物種中具有高度的同源性.“calciumbowl”對Ca2+有高度的選擇性,與通道的Ca2+敏感性有關,這也是通過Ca2+/CaM來實現(xiàn)的.然而,目前還沒有直接證據(jù)表明Ca2+/CaM在BK通道激活中發(fā)揮作用.4ca2+/最佳通道方法對視桿細胞cng通道門控敏感性的影響視桿細胞光感受器的光轉換和嗅覺神經元的嗅覺轉換是由環(huán)核苷酸門控通道(CNG)家族介導的,這些通道的打開需要有cAMP和cGMP的結合.CNG通道打開可使Na+和Ca2+進入感覺細胞,結果導致胞內cAMP(嗅覺神經元)或cGMP(視桿光感受器)信號的改變.很久以來,Ca2+就被認為在視覺和嗅覺適應性反應中起關鍵作用,但對其作用機理卻了解很少.最近,許多實驗室的研究認為Ca2+/CaM與CNG通道活動的調控有關[34,35,36,37,38,39].Ca2+/CaM影響視桿細胞CNG通道的方式與其影響嗅覺細胞CNG通道的方式相似,都是由于Ca2+/CaM與通道結合,降低了CNG通道門控敏感性,進而降低通道活性,但在具體細節(jié)上有一些不同.例如在嗅覺細胞CNG通道中,Ca2+/CaM主要是結合到α亞基上的;而在視桿細胞CNG通道中,Ca2+/CaM卻主要與β亞基相互作用.雖然視桿細胞CNG通道的α亞基也有Ca2+/CaM結合位點,但由α亞基構成的同聚體CNG通道的功能卻不受Ca2+/CaM調控.而由嗅覺細胞CNG通道的α亞基構成的同聚體通道的功能則受Ca2+/CaM調控.Vamum等研究發(fā)現(xiàn),Ca2+/CaM可結合到嗅覺細胞CNG通道α亞基的N末端上,通過影響通道N末端和位于C末端上的環(huán)核苷酸結合結構域的相互作用而降低通道開放概率(圖7).Scott等在研究果蠅視桿細胞時發(fā)現(xiàn),光刺激時,經CNG通道內流的Ca2+與CaM結合而激活CaM,活化的CaM反過來引發(fā)通道的失活,從而構成一種負反饋調控.最近研究還發(fā)現(xiàn),在植物中也存在CNG通道,Ca2+/CaM也能與它結合,但是其結合位點在CNG通道的C末端,這與動物不同.說明在進化過程中,動植物分別形成了不同的CNG通道調控機制[’39],總之,Ca2+/CaM對CNG通道活性的調控作用具有重要的生理意義,它提供了一種使通道失活并恢復到靜息狀態(tài)的負反饋機制.5ca2+/cd.cogca2+/最佳ca2+/cd的激活作用Ca2+/CaM除了主要對上述幾種離子通道和受體進行調控外,還對許多其他離子通道和受體,如N型乙酰膽堿受體(nAChR),α-氨基-3-羧基-5-甲基異噁唑-4-丙酸受體(AMPAR),紅藻氨酸受體(KAR),γ-氨基丁酸受體A型受體(GABAAR),甘氨酸受體(GlyR)以及電壓依賴性Na+通道(VDSC)等均有調控作用。據(jù)Liu等研究發(fā)現(xiàn),對于高通透Ca2+的α7-nAChR來說,它的反應過程中有活動依賴性功能“下調”(activity-dependentrundown)現(xiàn)象,這是Ca2+內流和/或胞漿Ca2+庫的釋放激活CaM,Ca2+/CaM再激活Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶II(CaMKII)的結果.鈣調神經磷酸酶(CaN)可抑制這一現(xiàn)象,而CaM則可促進這一現(xiàn)象·據(jù)Ghetti等報道,在新生大鼠海馬神經元中,由NMDAR或其他Ca2+內流通路介導的突觸活動,可能經CaN和CaMKII途徑調控KAR的功能.最近,我們發(fā)現(xiàn)在大鼠骶髓后連合核(SDCN)神經元中,經NM-DAR內流的Ca2+對GABAAR有抑制作用,這種抑制作用也是CaM依賴性的.我們還證明,經NMDAR和AMPAR內流的Ca2+可通過CaMKII和CaN的共激活而調控GlyR的功能,其中Ca2+/CaM起重要的作用(圖8).Saimi等報道,CaM也是Na+通道激活的一種決定性的生理因子,并且是Na+通道門控的Ca2+感受器.Mori等用酵母雙雜交方法研究電壓依賴性Na+通道的孔區(qū)形成亞基——α亞基時發(fā)現(xiàn),它的C末端有一個由3