阿托品對去甲腎上腺素大鼠模型的擴(kuò)血管作用

臨床上可用于治療性休克，擴(kuò)張微血管，緩解痙攣，改善微循環(huán)，緩解休克癥狀。其機(jī)制不能基于阻止m受體來解釋。對于阿托品的擴(kuò)血管作用機(jī)理,有以下幾種推測:是機(jī)體對阿托品引起的體溫升高的代償性散熱反應(yīng);與α腎上腺素受體有關(guān);與內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。盡管有報道阿托品擴(kuò)張NE預(yù)收縮家兔胸主動脈條和苯腎上腺素(PHE)預(yù)收縮家兔海綿體的作用不依賴于內(nèi)皮功能,但也有研究表明阿托品擴(kuò)張PHE預(yù)收縮大鼠胸主動脈、腎動脈以及腸系膜動脈為內(nèi)皮依賴性。本文旨在對阿托品擴(kuò)血管作用機(jī)理進(jìn)行研究。阿托品的糖代謝動力學(xué)wag動物Sprague-Dawly(SD)大鼠,體重180-220g,♀♂兼用,由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供。合格證:陜動證字08-005號。藥品及試劑阿托品和去甲腎上腺素(noradre￣naline,NE):天津金耀氨基酸有限公司產(chǎn)品;乙酰膽堿(acetylcholine,Ach):上海雪滿生物科技有限公司產(chǎn)品;L-Nω-硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-argininemethylester,L-NAME),TritonX-100,格列本脲片(glibenclamide,Glib)及吲哚美辛(indomethacin,Indo)均為Sigma公司產(chǎn)品;咖啡因(caffeine),熔點標(biāo)準(zhǔn)品,陜西省藥品檢驗所饋贈。主要儀器PowerLab數(shù)據(jù)記錄和分析系統(tǒng),包括軟件Chart5.0以及硬件8通道橋式放大器(ADInstrumentsCo.,Australia);FT03C張力換能器(GrassInstrumentCo.Quincy,Mass.,USA);Myograph恒溫浴漕(DMT,Denmark)。離體血管實驗大鼠斷頭處死,迅速取出腸系膜上動脈,浸入冷Krebs液中,顯微鏡下剝離血管周圍組織。去內(nèi)皮組在實驗前用0.1%TritonX-100灌注血管5s,然后用Krebs液灌注10s。將處理好的血管切成1mm長的圓筒段,將其套在兩個L型的金屬針上,其中一個連接FT03C張力換能器,另一個連微調(diào)裝置(調(diào)節(jié)負(fù)荷張力)。將安裝好的動脈環(huán)置入含有Krebs液2.5mL的37℃恒溫浴槽,持續(xù)通入含95%O2和5%CO2的混合氣體,pH保持7.4。實驗前,動脈環(huán)靜息負(fù)荷2mN,每20min換液1次,穩(wěn)定1.5h。以K+-Krebs液(含60mmol·L-1K+)檢驗動脈環(huán)收縮性,兩次收縮幅度相差小于10%者用于實驗。以Ach(1×10-5mol·L-1)檢驗內(nèi)皮功能,舒張率小于10%的認(rèn)為內(nèi)皮完全去除,大于75%的認(rèn)為內(nèi)皮完整。一氧化氮合酶(NOS)抑制劑L-NAME(1×10-4mol·L-1),環(huán)氧酶抑制劑Indo(1×10-5mol·L-1),β受體阻斷劑普萘洛爾片(Prop,5×10-6mol·L-1)以及KATP通道抑制劑Glib(1×10-5mol·L-1)均預(yù)孵育30min,后以NE(1×10-5mol·L-1)預(yù)收縮血管,收縮穩(wěn)定后累加濃度法加入阿托品,繪制阿托品舒張的量效曲線。統(tǒng)計學(xué)分析以動脈環(huán)最大收縮幅度為100%,計算阿托品的舒張率。結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示并進(jìn)行方差分析及t檢驗,以P<0.05為顯著性指標(biāo)。結(jié)果1阿托品對全國范圍內(nèi)最大張力血管的擴(kuò)張作用以1×10-5mol·L-1NE預(yù)收縮血管,穩(wěn)定后濃度累加法加入阿托品。從圖1結(jié)果可見,阿托品能濃度依賴性地舒張NE預(yù)收縮完整內(nèi)皮的血管,其最大舒張率(Rmax)為(90±6)%(n=8),pEC50為5.51±0.25。阿托品亦能濃度依賴性地舒張NE預(yù)收縮的去除內(nèi)皮的血管,但其舒張作用明顯減弱,Rmax為(67±8)%,與完整內(nèi)皮的血管比較P<0.01;對去除內(nèi)皮血管阿托品舒張的pEC50為5.24±0.14,與內(nèi)皮完整組相比P<0.05。2阿托品作用下kcl量效關(guān)系去內(nèi)皮血管,穩(wěn)定1.5h,濃度累計法加入KCl(10,20,40和80mmol·L-1),得量效曲線。后沖洗標(biāo)本至基線,加入阿托品(1×10-4.5mol·L-1)作用10min,同法加入KCl獲得阿托品作用下的KCl量效曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿托品對KCl量效曲線無明顯影響(圖2)。3阿托品對無鈣krebs液中ni和cacl2縮血管效應(yīng)的抑制效果去內(nèi)皮血管,平衡1.5h后,用K+(60mmol·L-1)和Ach(1×10-5mol·L-1)分別檢驗血管活性和內(nèi)皮功能,合格后,換用無鈣Krebs液(正常Krebs液中無CaCl2并加入Ca2+絡(luò)合劑1×10-4mol·L-1EGTA),孵育5min,然后加1×10-5mol·L-1NE,可見動脈環(huán)產(chǎn)生迅速而短暫的收縮,平穩(wěn)后加入1mmol·L-1CaCl2,可見動脈條再次收縮并達(dá)峰值,作為藥前對照。然后用Krebs液反復(fù)沖洗5次,平衡45min,加入無鈣Krebs液的同時分別加入不同濃度阿托品(1×10-5.5,1×10-5和1×10-4.5mol·L-1)作用5min,重復(fù)上述實驗。實驗結(jié)束前再做1次無鈣NE收縮對照,收縮高度與用藥前對照基本一致。計算阿托品對無鈣Krebs液中NE或CaCl2縮血管效應(yīng)的抑制率。阿托品1×10-5.5,1×10-5和1×10-4.5mol·L-13個濃度對NE誘導(dǎo)收縮的抑制率分別為(36±17)%,(57±22)%和(75±11)%;阿托品3個濃度對CaCl2誘導(dǎo)收縮的抑制率分別為(19±13)%,(40±21)%和(64±19)%。經(jīng)檢驗,阿托品舒張血管的作用有明顯的濃度依賴關(guān)系(表1),說明阿托品能濃度依賴性地明顯抑制NE誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放以及經(jīng)受體操縱性鈣通道(receptoroperatedcalciumchannel,ROCC)的外鈣內(nèi)流,提示阿托品的擴(kuò)血管作用與ROCC以及內(nèi)鈣釋放有關(guān)。n=8,xˉ±s.?P<0.05,**P<0.01vsn=8,xˉ±s.*Ρ<0.05,**Ρ<0.01vscontrol;△P<0.05vsatropine(1×10-5mol·L-1)group4阿托品的抑菌活性完整內(nèi)皮動脈,分別以L-NAME(1×10-4mol·L-1)和Indo(1×10-5mol·L-1)預(yù)孵育30min阻斷一氧化氮(nitricoxide,NO)和前列環(huán)素(prostaglandinI2,PGI2)途徑,觀察阿托品的舒張效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),L-NAME和Indo對阿托品的擴(kuò)血管作用無明顯影響(抑制率分別為6.0%和-5.7%)。5阿托品的拉伸試驗去除內(nèi)皮血管,Prop(5×10-6mol·L-1)和Glib(1×10-5mol·L-1)預(yù)孵育30min,NE預(yù)收縮大鼠腸系膜動脈,穩(wěn)定后按濃度梯度法加入阿托品,觀察阿托品的舒張效應(yīng)。結(jié)果表明,β受體阻斷劑Prop和KATP通道阻斷劑Glib對阿托品擴(kuò)血管作用均無顯著性影響(抑制率分別為3.9%和0.2%)。6阿托品對krebs-l-1的抑制率去除內(nèi)皮血管,于無鈣Krebs液中加入30mmol·L-1咖啡因,可見動脈環(huán)產(chǎn)生迅速而短暫的收縮,作為藥前對照。然后用正常Krebs液反復(fù)沖洗并平衡45min。再在無鈣Krebs液中加入1×10-4.5mol·L-1阿托品后,重復(fù)上述實驗。實驗發(fā)現(xiàn),阿托品組與對照組的抑制率分別為(14±10)%和(14±18)%,兩者差異無顯著性。表明在無鈣液中阿托品對咖啡因誘導(dǎo)的血管收縮無明顯影響。阿托品在擴(kuò)血管效應(yīng)中的作用NE不僅可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣釋放,也可誘導(dǎo)細(xì)胞外鈣經(jīng)ROCC內(nèi)流而收縮血管。實驗發(fā)現(xiàn)阿托品能舒張NE預(yù)收縮的血管,且內(nèi)皮去除后該作用降低,說明阿托品舒張作用有一定的內(nèi)皮依賴性。目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)是由NO,PGI2及EDHF共同作用完成的,本實驗發(fā)現(xiàn)NOS抑制劑L-NAME和環(huán)氧酶抑制劑Indo對阿托品的擴(kuò)血管作用無明顯影響,表明阿托品源于內(nèi)皮的擴(kuò)血管作用與NO和PGI2途徑無關(guān),可能與EDHF有關(guān),這正與臨床上阿托品用于感染性休克(改善微循環(huán))一致。因為存在著一種EDHF在微小阻力血管中介導(dǎo)血管舒張的代償機(jī)制,Ach介導(dǎo)的微血管舒張主要靠EDHF的調(diào)節(jié),其作用較NO強(qiáng)。因此阿托品被用于改善微循環(huán)障礙可能部分是由于其促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞層釋放EDHF,從而起到擴(kuò)張阻力血管的作用。在考察血管平滑肌在阿托品擴(kuò)血管效應(yīng)中的作用時發(fā)現(xiàn),β受體阻斷劑Prop和KATP通道阻斷劑Glib對阿托品的擴(kuò)血管作用均無顯著性影響,提示阿托品的擴(kuò)血管作用與β受體及KATP通道無關(guān)。離體血管在含鈣營養(yǎng)液中,高鉀誘導(dǎo)細(xì)胞膜電位去極化,激活電壓依賴性鈣通道(voltagedependentcalciumchannel,VDCC),引起胞外鈣內(nèi)流而誘發(fā)血管收縮。實驗中發(fā)現(xiàn)阿托品對KCl量效曲線無明顯影響,說明其不能抑制外鈣經(jīng)VDCC內(nèi)流。在無鈣液中NE和咖啡因引起的快速而短暫的收縮認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放所致,將CaCl2加入浴槽中引起的繼續(xù)收縮認(rèn)為是細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流的結(jié)果。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放有IP3受體和Ryanodine受體-Ca2+釋放途徑。咖啡因作為研究Ryanodine受體-Ca2+釋放途徑的一種工具藥,主要通過后者起作用。實驗發(fā)現(xiàn),阿托品能濃度依賴性地抑制NE誘導(dǎo)的內(nèi)鈣釋放以及經(jīng)ROCC的外鈣內(nèi)流,提示阿托品的擴(kuò)血管作用與ROCC以及內(nèi)鈣釋放有關(guān);但阿托品對咖啡因引起的血管收縮無明顯影響,提示阿托品可能主要通過抑制IP3受體中介的鈣釋放起作用,對Ryanodine受體途徑無明顯影響。與以往多采用胸、腹及肺主動脈等彈性貯器血管來研究阿托品的擴(kuò)血管作用不同