紅酵母發酵類胡蘿卜素的研究

類胡克是一個大型的天然色素家族，總共600種。其在生物體內的作用有很多,如參與綠色植物的光合作用,動物體內合成維生素A的前體,抗氧化及減少癌癥的發生和發展、減少心血管疾病發病率、增強免疫功能等獨特的生理功能。其中β-胡蘿卜素在生產生活當中的應用非常廣泛,可以添加到飼料、食品、化妝品以及藥品中,市場前景十分廣闊。由于食品工業、養殖業迅速發展使生物來源的類胡蘿卜素倍受關注,利用微生物生產類胡蘿卜素是獲得生物資源型類胡蘿卜素的最重要的途徑。利用紅酵母發酵生產類胡蘿卜素具有營養需求簡單,生產周期短等優點,但目前所報道的紅酵母產量均較低,所以尋找優良的菌種和培養基成為亟待解決的問題。本研究通過單因素和正交試驗對比2種基礎培養基,尋找紅酵母的最佳生長條件,為今后進一步提高類胡蘿卜素的產量奠定了試驗基礎。1材料和方法1.1病毒紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa):大連工業大學資源開發利用研究所分離保存。1.2生化試劑及培養基葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉、丙酮、磷酸氫二銨、尿素、氯化銨均為生化試劑和分析純。斜面活化培養基:4%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,2%瓊脂粉,自然pH值。種子液體培養基:2%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,自然pH值。液體發酵培養基:2%葡萄糖,1%蛋白胨,1%酵母膏,用5%NaOH調pH值為6。1.3測試方法1.3.1液體種子培養基種子液培養:從活化的斜面培養基中取2環紅酵母菌體放入裝有50mL液體種子培養基的三角瓶(250mL)中,28℃、120r/min搖床暗箱培養24h。發酵液培養:取種子液5mL置于裝有50mL培養液的三角瓶(250mL)中28℃、120r/min暗箱培養3d。1.3.2類胡蘿卜素浸提液的制備生物量的測定:細胞干重法,將培養后的發酵液3000r/min離心15min得紅酵母菌體,75℃烘干12h至恒重稱量。細胞破壁與提取方法:采用酸-熱破壁法:將0.1g干菌體放入100mL三角瓶中,加入5mL3mol/L的鹽酸室溫浸泡1h,沸水浴3min,迅速冷卻,6000r/min離心15min沉淀為細胞殘渣,用丙酮定容至10mL萃取,得類胡蘿卜素浸提液,如細胞碎片中仍有色素,加丙酮進一步提取,合并上清液。類胡蘿卜素含量(簡稱色素)的測定,計算公式:式中:Aλmax為最大吸收波長475nm處的吸光度值;V為提取所用有機溶劑的總體積,mL;D為浸提液稀釋倍數;W為干酵母菌體重量,g;0.16為類胡蘿卜素的消光系數。1.3.3ds溶液的制備3,5二硝基水楊酸法制作葡萄糖濃度標準曲線:稱取1g葡萄糖溶于100mL容量瓶,分別取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL,去離子水定溶至3mL,加1.5mLDNS溶液,沸水浴5min迅速冷卻。冷卻后定容至25mL,在波長540nm處測量吸光度值,標準曲線見圖1。2結果與分析2.1培養基碳源和類胡蘿卜素含量的確定分別取2%葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖和果糖,其他培養基成分和培養條件不變,紅酵母的生物量和類胡蘿卜素含量見圖2。其中生物量最高為果糖,其次為蔗糖和葡萄糖,但是這3種碳源中葡萄糖培養的紅酵母中類胡蘿卜素含量較高,從成本和產量總體考慮選擇葡萄糖和蔗糖作為候選碳源。分別取1%蛋白胨、磷酸氫二銨、尿素和氯化銨,其他培養基成分和培養條件不變,紅酵母的生物量和類胡蘿卜素含量見圖3。從圖3可以看出,蛋白胨的生物量最大,其次是磷酸氫二銨,但是磷酸氫二銨中類胡蘿卜素的含量要大于蛋白胨,這是因為磷酸氫二銨對發酵液具有緩沖作用,并且含有磷源,對紅酵母合成類胡蘿卜素有促進作用,所以試驗選擇蛋白胨和磷酸氫二銨作為候選氮源。從圖2和圖3觀察到,在試驗條件下,生物量較小時色素含量很高,這是因為類胡蘿卜素是一種從TCA循環得到的中間產物進一步合成的次級代謝產物,主要在穩定期合成積累。當培養基中添加乳糖和尿素時,紅酵母較快進入穩定期,類胡蘿卜素含量得到一段時間積累,含量較高。綜合考慮,選擇2組基礎培養基,葡萄糖組:葡萄糖+蛋白胨+酵母膏;蔗糖組:蔗糖+磷酸氫二銨+酵母膏。2.2葡萄糖組各組分的加入量確定2.2.1葡萄糖添加量對紅酵母胞內色素含量和產量的影響保持蛋白胨和酵母膏含量不變,考察葡萄糖的添加量,結果見圖4。當葡萄糖添加量為1%時,由于濃度過小,使紅酵母較早進入穩定期,所以色素含量較大,但是當濃度>3%時生物量與色素產量都有所下降,選擇葡萄糖添加量為3%,此時的生物量、胞內色素含量和產量分別為9.92g/L、120.00μg/g、1.19mg/L。2.2.2產量和產量保持葡萄糖和酵母膏含量不變,考察蛋白胨的添加量,結果見圖5。蛋白胨添加量為1.5%時細胞內的色素含量最大,產量也最大。當添加量為2.0%時生物量最大,說明在此添加量時細胞仍未進入到穩定期,更加適合紅酵母細胞生長,并且可以通過培養條件的優化,得到類胡蘿卜素含量的積累,所以選擇2.0%作為蛋白胨的最佳添加量,此條件時的生物量、胞內色素含量和產量分別為10.54g/L、118.13μg/g、1.25mg/L。2.2.3培養基營養補充劑酵母膏中富含蛋白質、氨基酸、多肽、核苷酸、B族維生素等微量元素的一種氮源,研究將其作為培養基的營養補充劑添加。考察酵母膏的添加量對紅酵母發酵的影響見圖6。酵母膏添加量為1.5%時,生物量和類胡蘿卜素產量最大,所以選擇酵母膏的最佳添加量為1.5%,此條件時的生物量、胞內色素含量和產量分別為11.38g/L、120.63μg/g、1.37mg/L。2.3最佳教育條件的確定培養條件的確定以上述最適培養基組分配比為前提,尋找紅最適合類胡蘿卜素生成和積累的培養條件。2.3.1初始ph值對紅酵母生長和產量的影響初始pH值對紅酵母發酵的影響見圖7。由圖7可見,紅酵母可以再初始pH值為5~8時均可較好生長,當初始pH值為6時類胡蘿卜素的含量和產量都較大,所以選擇初始pH值為6。2.3.2紅酵母細胞代謝溫度對紅酵母發酵的影響結果(圖8)可見,30℃是類胡蘿卜素的最適積累溫度,這是由于紅酵母細胞內參與代謝的酶最適溫度不一致。在此溫度條件下初級代謝相對較弱,使得合成類胡蘿卜素的次級代謝前體物質較多,導致紅酵母細胞內的色素合成數量增加,30℃應該是紅酵母代謝類異戊二烯途徑中所需酶的最佳反應溫度,所以選擇30℃為最適培養溫度。2.3.3類胡蘿卜素的合成搖床轉速對紅酵母發酵的影響見圖9。一般情況下,搖床轉速越高,培養基中的溶解氧越多。當搖床轉速達為180r/min時,生物量有小幅度增加,但是類胡蘿卜素的含量開始下降,因為溶解氧比較多,紅酵母的TCA循環比較旺盛,初級代謝較強,菌體生物量較大,導致合成類胡蘿卜素的中間產物較少,所以類胡蘿卜素的合成比較少。最佳搖床轉速選擇160r/min。2.3.4物質積累的特點以上述單因素試驗確定的最佳條件考察紅酵母菌體生長及類胡蘿卜素積累。從圖10可以看出,紅酵母發酵在120h后進入穩定期,在最后培養的48h內生物量僅增加了0.36g/L。類胡蘿卜素符合次級代謝產物積累的特點,168h的培養時間內一直在增加,穩定期時積累速度加快,168h時色素含量最大,為176.6μg/g,產量為2.54mg/L。通過對發酵液pH值和殘糖測量結果(表1)可以看出,紅酵母發酵可以分為2個階段:第1階段為從開始到96h時,微生物主要利用發酵液中的葡萄糖,通過糖酵解途徑和檸檬酸循環進行初級代謝,分泌代謝出有機酸,使發酵液pH值呈下降趨勢;當發酵液中葡萄糖含量不足時紅酵母進入到過渡期,紅酵母細胞一方面利用葡萄糖,一方面利用代謝出的有機酸,令發酵液中葡萄糖含量進一步下降,pH值升高,發酵進入到第2階段;穩定期的葡萄糖含量和發酵液pH值也比較穩定。2.4培養基配比試驗以葡萄糖組添加量為參考,設計正交試驗的各因素及其濃度水平見表2,結果見表3,方差分析見表4。從表3與成本方面考慮,第8組試驗為最佳培養基配比,即蔗糖4%,磷酸氫二銨1.5%,酵母膏1%,培養168h。最大產量為2.53mg/L,與葡萄糖組培養168h的最大產量2.54mg/L相似。從表4可以看出,蔗糖添加量對紅酵母發酵產類胡蘿卜素影響顯著,這是因為培養基中的蔗糖不僅可以為紅酵母生長提供能量,并且是其合成類胡蘿卜素時碳元素的來源。3紅酵母發酵過程中殘糖和總ph值的變化試驗選擇2組適合紅酵母發酵的培養基組分,分別研究其添加量對紅酵母發酵生產類胡蘿卜素的影響,通過生物量選擇培養基,色素含量選擇培養條件以得到紅酵母的最大產量,得出以下結論:(1)葡萄糖組最佳添加量為3%葡萄糖,2.0%蛋白胨,1.5%酵母膏,此時的生物量、色素含量和產量分別為11.38g/L、120.63μg/g、1.37mg/L。(2)紅酵母產色素的最佳培養條件為pH值為6,溫度30℃,搖床轉速160r/min,培養時間168h,此時的生物量、色素含量和產量分別為14.38g/L、176.6μg/g、2.54mg/L。(3)在紅酵母發酵過程中分析了殘糖以及pH值隨時間的變化,發現紅酵