登革病毒易感細胞的研究進展

感染屬于黃毒科。有四種類型的血清素，通過埃及和白紋伊蚊傳播。登革病毒感染可引起登革熱(denguefever,DF)、登革出血熱(DHF)和登革休克綜合征(DSS)。其中DHF和DSS已成為全球的主要公共問題,尤其是在熱帶和亞熱帶國家,威脅著全世界大約40%人口的健康。DF是1998年后繼瘧疾后最重要的熱帶感染性疾病,WHO估計登革病毒的感染每年導致1億DF、50萬DHF和25000人死亡。登革病毒可以通過兩種機制感染宿主細胞,即與病毒特異性抗體(IgG)形成病毒復合體與一些細胞上的Fc受體結合,或者病毒包膜表面糖蛋白直接與宿主細胞上特異性受體結合。對第一種機制的研究發(fā)現:DHF或DSS時病毒滴度的增高與這種IgG-Fc介導的抗體增高有關,而對于第二種機制的研究較少。此外,登革病毒可以感染不同組織來源的多種細胞,至今,可以從功能上把這些受體分為兩種類型:第1種是氨基聚糖類,如硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS),它們是吸附病毒的始動因子,可以引起病毒顆粒的聚集和濃度的升高;第2種是一些相對分子質量大小不同的蛋白質,對這些蛋白質空間結構的研究成為受體研究的重點。1結構域區(qū)的概念病毒感染的早期現象是病毒的吸附及穿入。病毒吸附蛋白(virionattachmentprotein,VAP)與細胞膜表面特異性病毒受體的結合往往決定了病毒的組織、細胞親嗜性及發(fā)病機制。登革病毒的VAP為包膜蛋白E,X射線晶體衍射技術已明確了其三維結構:E蛋白是由兩單聚體組成的同源二聚體,每個單聚體折疊成3個不同的區(qū)域:結構域Ⅰ區(qū)是一個β-桶狀中心結構,由8個β-折疊形成,兩個二硫鍵起維持結構域穩(wěn)定的作用;結構域Ⅱ區(qū)是一個延伸的指狀結構,可能與E蛋白二聚體的形成及膜融合過程相關;結構域Ⅲ區(qū)為免疫球蛋白樣折疊,由羧基末端區(qū)形成且延伸至病毒表面,含有大量天冬氨酸及堿性氨基酸,認為此結構域為細胞受體的結合位點;結構域Ⅲ區(qū)在受體識別中起重要作用,研究顯示此結構域的突變會引起病毒毒力的減弱,逃避機體的免疫捕獲。結構域Ⅲ的第380～389氨基酸合成的多肽,抑制了登革病毒與C6/36細胞的結合。但也有研究提出:E蛋白Ⅲ區(qū)對病毒與宿主細胞的結合作用并非具有獨立性,相反,一個或者多個結構域Ⅱ的氨基酸的改變可能在病毒最初的攻擊中起主要作用。2病毒輔覆蛋白結合分析登革病毒在自然界主要以埃及伊蚊和白紋伊蚊作為傳播媒介。C6/36細胞是從白紋伊蚊胚胎期分離出的一株細胞系,對登革病毒易感。Juan等用放射標記的登革-4型病毒在C6/36細胞上鑒定的受體的相對分子質量分別為45000和40000;用高碘酸鈉(sodiumperiodate,能特異性去除蛋白分子上的糖鏈結構)處理C6/36細胞蛋白后做病毒輔覆蛋白結合分析(virusoverlayproteinbindassay,VOPBA)實驗,發(fā)現45000和40000兩蛋白條帶都消失了,而在35000～37000處出現惟一的受體蛋白分子,推斷45000和40000兩分子是35000～37000處的蛋白分子不同糖基化水平生成的。Chee等用VOPBA及質譜分析技術在C6/36細胞上鑒定出一個大小為48000的微管蛋白樣分子D2BP,研究發(fā)現游離的D2BP可以抑制病毒與細胞的連接,提示此蛋白為登革病毒在C6/36細胞上的受體。因為登革病毒E蛋白上沒有與微管相關蛋白(MAPs)及可以與微管蛋白結構相連接的驅動蛋白及動力蛋白相似的結構,現在還不清楚登革病毒是如何進入蚊細胞的。作者推測蚊細胞與登革病毒的最初作用是通過非蛋白-蛋白之間的連接(如通過HS或凝集素),這種連接造成了靶細胞空間構型的改變,從而有利于病毒E蛋白與C6/36上受體的連接及病毒的內化。在西尼羅病毒的研究中發(fā)現此蛋白在病毒入侵以后病毒顆粒的組裝及轉運中起作用,它通過與病毒的連接提供病毒顆粒組裝的支架,由此推斷此受體在登革病毒入侵后的復制過程中可能也有重要作用。3感染抑制實驗結果已知單核/巨噬細胞(monocytesandmacrophages)是登革病毒感染的主要靶細胞之一,且它的感染有利于病毒的擴散。Chen等發(fā)現LPS可以阻斷登革病毒感染單核/巨噬細胞,作者當時預測這種作用可能是因為LPS與細胞上連接結構相連,這些連接結構恰是登革病毒進入細胞的受體。對這種連接結構的預測最近得到證實。在登革病毒感染的單核/巨噬細胞細胞表面分離出84000和70000～75000大小的兩種蛋白,質譜分析表明分別為熱休克蛋白90(HSP90)和HSP70。單核細胞上HSP90和HSP70的單克隆抗體的陽性結果表明上面有HSP90和HSP70的表達。感染抑制實驗則提示兩者只是登革病毒在單核/巨噬細胞上受體的一部分。HSP90和HSP70有許多功能:如蛋白質折疊、多肽的免疫呈遞、分子伴侶等。此外還可以表達于細胞膜表面作為細胞表面受體。作為細胞表面受體的HSP90和HSP70有兩種作用:一是介導LPS樣效應;二是在LPS作用于單核/巨噬細胞時作為一種CD14非依賴型細胞表面功能性受體。這可以解釋為什么LPS可以阻斷登革病毒對單核/巨噬細胞的感染:當LPS與單核/巨噬細胞作用時,封閉了細胞表面的HSP90和HSP70受體,這些受體同樣也是登革病毒的受體,因此阻斷了登革病毒的感染。4hs和grp鋼的相互作用最近研究證實登革病毒可以感染肝細胞。Liu等研究了登革病毒與5株肝細胞株(HuH-7、HA22、Hep3B、PLC、Changliver)的相互作用,發(fā)現HS的類似物肝素,可以競爭性抑制登革病毒-2在細胞中的復制。事實上,許多細胞表面均發(fā)現了高電荷的HS,這是和肝素一樣的氨基葡聚糖(glycosaminoglycans,GAGs),可以作為受體與所有4型登革病毒E蛋白結合。除了以上5種肝細胞,經研究證實登革病毒感染Vero、HL60、BMI3674也是通過細胞表面的GAGs。但有研究發(fā)現一些沒有GAG的細胞仍然具有結合登革病毒的能力,且用肝素酶處理可以增加登革病毒的結合,表明GAGs并不是登革病毒感染細胞所必需的。事實上肝素為高度帶電分子,它的抑制作用有可能是通過干擾靶細胞與病毒的相互作用而實現的。目前較為合理的解釋是HS使病毒顆粒黏附于細胞,但這種黏附作用是可逆的,病毒需要特異性高親和力受體才能最終進入靶細胞。Jindadamrongwech等通過VOPBA和質譜印跡等方法在登革病毒-2感染的HepG2細胞膜上發(fā)現了葡萄糖調節(jié)蛋白78[glucoseregulatedprotein78,GRP78(Bip)],可以和登革病毒E蛋白結構域Ⅲ區(qū)上免疫球蛋白樣結構連接。GRP78(Bip)是一種免疫球蛋白重鏈連接蛋白,與缺少輕鏈的免疫球蛋白的重鏈連接。多種細胞表面有GRP78(Bip)的表達,它是細胞表面伴侶素的一種。在柯薩奇病毒(Coxsackievirus,CoxV)的研究中GRP78(Bip)作為病毒共受體的一部分,參與病毒與細胞之間的相互作用。同樣研究發(fā)現GRP78可能也只是登革病毒在肝細胞上受體的一部分。更深入的研究需要將GRP78(Bip)的單克隆轉染給一個對登革病毒非易感的細胞,觀察此細胞系是否轉化為對登革病毒的易感細胞系。用同樣的方法Thepparit等在登革病毒感染的HepG2上測出一個相對分子質量為大約37000的分子,質譜測定儀分析表明此分子為37000/67000高親和力的層粘連蛋白受體。37000/67000是一種非整聯蛋白性質的細胞表面受體分子,介導細胞與層粘連蛋白的相互作用,可以表達于正常人肝細胞的表面,在肝癌細胞此分子的表達會上調。37000是蛋白的前體,成熟以后為67000大小分子的層粘連蛋白受體。已經證實37000/67000高親和力的層粘連蛋白受體可以介導多種病原體的入侵,包括朊蛋白,節(jié)肢動物源性包膜RNA病毒。由C6/36細胞膜表面鑒定的大小為32000的蛋白分子被推測為委內瑞拉馬腦炎病毒在蚊細胞膜上的層粘連蛋白受體。通過體外感染抑制實驗和直接的免疫抑制實驗,發(fā)現此受體的單克隆抗體及可溶性層粘連蛋白均可抑制登革病毒1的感染,這種抑制作用呈劑量依賴性。但同樣的抑制作用未出現在登革病毒2、3、4,表明此受體有病毒的型的特異性。Tio等的實驗卻表明可以與37000/67000lamininreceptor(LAMR1)相互作用的是登革病毒3、4型。造成實驗結果大相徑庭的原因尚不清楚。5免疫抑制劑的性質及細胞的選擇性已知樹突狀細胞(dendriticcell,DC)是登革病毒感染的靶細胞。表達于DCs表面的甘露糖特異的C-型凝集素受體(DCspecificICAM-3grabbingnon-integrin,DC-SIGN),最近被證明是連接埃博拉病毒、巨細胞病毒及HIV與DC連接的受體成分。Navarro-Sanchez等在研究了DC在登革病毒入侵過程中的作用后認為DC-SIGN起到了關鍵作用。作者用表達有DC-SIGN的未成熟DCs作研究細胞,結果顯示這種細胞可以被登革病毒1感染。進一步的研究發(fā)現DC-SIGN是通過本身的碳水化合物識別域(carbohydrate-recognitiondomain,CRD)與DC細胞膜表面富集甘露糖的低聚糖上的甘露糖殘基相結合的。用DC-SIGNCDR特異性單克隆抗體1B10或8A5或其可溶性外功能區(qū)單克隆抗體可以減少90%登革病毒感染,而登革病毒-E蛋白的中和性單克隆抗體只減少了70%的病毒的感染。用THP-1細胞及THP-1/DC-SIGN細胞(轉染了DC-SIGN表面分子)研究發(fā)現:轉染了DC-SIGN的THP-1細胞可以感染登革病毒且呈劑量依賴性。以上實驗均表明:DC是登革病毒的靶細胞,DC-SIGN是登革病毒進入DC的分子基礎。作為一種目前所知的機體內功能最強的抗原呈遞細胞(antigenpresentingcell,APC),同時又是激發(fā)初始T細胞反應的惟一細胞,DC在包括病毒、細菌、寄生蟲等病原體感染以及介導病毒的入侵,呈遞病毒抗原,調節(jié)機體抗病毒免疫的過程中發(fā)揮極其重要的作用。但也有研究者提出,DC的作用并不都是有利于機體清除病毒的。目前又發(fā)現一種與DC-SIGN密切相關的C型凝集素受體-DC-SIGN-relatedmolecule,DC-SIGN/L-SIGN)。Tassaneetrithep等的研究就證實DC-SIGN和L-SIGN可介導登革病毒的感染,不僅大量DC通過DC-SIGN和L-SIGN大量感染登革病毒,而且這些細胞還可以復制病毒,增強病毒感染。以至于非常微量病毒就能帶來有效感染。病毒受體是宿主基因組編碼、控制和表達的一組蛋白質,它參與病毒與靶細胞的相互作用,使病毒吸附在細胞表面。在病毒受體的介導下,病毒最終進入細胞進行復制。因此,細胞上的病毒受體與病毒的宿主范圍和組織嗜性密切相關。過去認為病毒與細胞的相互作用是通過病毒的某個成分直接識別和(或)通過病毒吸附蛋白結合到細胞表面的單個分子上。近年來,由于各種新技術的發(fā)展和應用,相繼分離出了多種病毒的受體,同時在病毒受體的本質及病毒和受體相互作用機制等研究方面取得了很大的進展。事實上,病毒