一種抗赤潮毒素的貝毒提取液的制備及檢測方法的建立

近年來，中國沿海潮漲頻繁。赤潮不僅破壞海洋漁業資源和生產,惡化海洋環境,更嚴重的是,有些赤潮種類能產生毒素,在海產品體內長期富集,當人們食用赤潮毒素污染的海產品后就可能出現中毒現象甚至死亡。根據對人類的中度癥狀和機制差異可將赤潮毒素分為以下5種:麻痹性貝毒(paralyticshellfishpoisoning,PSP)、腹瀉性貝毒(diarrheticshellfishpoisoning,DSP)、記憶缺失性貝毒(amnesiashellfishpoisoning,ASP)、神經性貝毒(neurotoxicshellfishpoisoning,NSP)和西加魚毒(ciguaterafishpoisoning,CFP)。其中,PSP和DSP是我國海洋赤潮生物中最常見的2種。海產品繼病原菌、弧菌和病毒之后,赤潮毒素又成為威脅海產品質量的另一問題。因此,對海產品的麻痹性貝毒進行檢測對于保證廣大消費者健康安全有重要意義。1材料和方法1.1水產品市場市場樣品采自上海市幾個重要的海產品批發市場,主要有滬西水產品、銅川水產品、曹安四平水產品、福山路水產品市場。采集的種類主要為貽貝、海灣扇貝、扁玉螺等常見的海產品,有些也是赤潮毒素敏感種類。1.2實驗動物的制備PSP的小鼠生物檢測方法按照AOAC標準方法進行。打開貝殼,取一定量的軟組織置于勻漿器中勻漿,稱100g勻漿加入100ml0.1mol/LHCl,攪勻后調pH值為2～4。水浴煮沸5min;冷卻至室溫后再調pH為2～4,然后離心(3000r/min)5min,上清液即為貝毒提取液。取8只小鼠,稱重后,在每只腹腔內注射1ml貝毒提取液,記錄小鼠的死亡時間。實驗小鼠購自中國科學院上海實驗動物中心,測試品系為KM系雌性小鼠。所測麻痹性貝毒的毒力用100g貝類軟組織含有的鼠單位(MU)表示,1個鼠單位的定義是15min內殺死1只20g重小鼠的腹腔注射劑量。1.3毒種毒素化合物檢測選擇幾份小鼠法已檢測有毒的樣品進一步用HPLC檢測。PSP的檢測采用高碘酸柱前衍生化方法進行。上述貝毒提取液經0.45μm濾膜過濾后,即可用高碘酸進行氧化。0.3mol/LNa2HPO4、0.3mol/L甲酸銨和0.03mol/L高碘酸等體積比混合,配制高碘酸混合液。在1.5ml的Micro-Tube中加100μl的樣品或毒素標準物(pH=7)及500μl新配制的高碘酸混合液,在室溫下反應1min,加入5μl冰醋酸以終止反應。均勻混合后靜置10min,注射50μl反應產物進入HPLC系統中。HPLC條件:Waters600四元梯度泵,WaterssymitryRP-18柱(4.6mm×150mm),Waters474熒光檢測器。流動相為二元流動相,A相為0.1mol/L的甲酸銨溶液,B相體積分數為5%的乙腈溶液,流量為1ml/min。熒光檢測器的激發波長為330nm,發射波長為390nm。毒素標樣為GTX1/4、NEO、GTX2/3和STX。這幾種毒素化合物的檢測限為:GTX1/4,69pg;NEO,37pg;GTX2/3,40pg;STX:37pg。所用液體試劑均為色譜純。2樣品的毒力檢測小鼠法共檢測出8份樣含有PSP,這些樣品分別是5月份的海灣扇貝(2份),六月份的海灣扇貝(2份)和扁玉螺(1份),7月份的海灣扇貝(1份),10月份的海灣扇貝(1份)和扁玉螺(1份)。毒力范圍是159.81～615.66MU/100g。8和9月份樣品沒有檢測出PSP。有毒的樣品大部分采自滬西和銅川水產市場(表1)。HPLC法對5份有毒的樣品檢測表明,6和7月份的海灣扇貝樣品10月份扁玉螺樣品含有PSP毒素,其含量分別為1.94、0.48和0.19μg/100g,主要成分是GTX2/3而另外2份樣品未檢測出PSP毒素(表2)。3赤潮毒素風險PSP是一種神經性毒素,能造成神經系統傳輸障礙而產生麻痹作用。對人體的中毒量為600～5000MU,致死量為3000～30000MU。WHO規定,100貝類可食部分的PSP毒力超過400MU(相當于80μgSTX)時不得食用。我國的PSP的警戒標準和WHO的標準一致。根據這一標準,5月份在滬西和銅川水產市場采集的海灣扇貝樣品PSP含量都超出警戒值,應禁止食用。其他幾份有毒樣品的PSP含量雖沒有超出警戒值,但應少量食用或避免食用。從種類上看,有毒的海產品主要為海灣扇貝、扁玉螺等,這些種類貝類為赤潮毒素敏感種類,食用時應當謹慎。關于PSP,國內也有不少報道。林燕堂等用小白鼠法對廣東沿海的PSP做了一些研究,發現華貴櫛孔扇貝、櫛江珧和翡翠貽貝含毒素量較高,而牡蠣、蚶和青蛤等貝類含毒素量較低。YU等利用優化的HPLC方法對中國貝類和的PSP的檢測分析表明,連云港有一些貝類樣品,含有PSP毒素;江天久等用HPLC法對廣東大亞灣的華貴櫛孔扇貝和翡翠貽貝所含的PSP進行分析,發現2種貝類消化腺的毒素成分相同,主要為GTX5和C1/2。除上述至毒生物種類外,還有菲律賓蛤仔、紅帶織文螺和織文螺等。因此,為確保上海市海產品的食用安全,應對上述生物種類進行重點檢測。小白鼠生物檢測法和高效液相色譜法是檢測赤潮毒素的2種常用方法。小白鼠法相對簡單,能對所抽提的全部毒素的毒性測定,使用最為廣泛,是目前被所有實驗室認可的標準檢測方法。但小白鼠法不能測定毒素的含量和組分,而且容易出現假陽性現象。而HPLC法正好彌補了這些缺點。現HPLC檢測結果也表明,引起小白鼠死亡的物質并非都是PSP的主要成分,也可能為其他類型的有毒化合物。同時,HPLC法也有一定的缺點,那就是毒素標準物質難以全部