工程名稱：基于核酸適配體的蛋白質研究新技術和新方法首席科學家：譚蔚泓湖南大學起止年限：2023.1至2023.8依托部門：教育部二、預期目標總體目標:本工程針對當前蛋白質研究中存在的瓶頸問題，開展基于核酸適配體的蛋白質研究新技術新方法；以肝癌和食管癌為研究對象，面向我國社會開展中提高人類健康的重大需求，通過建立肝癌和食管癌相關蛋白的發現、別離分析、檢測表征等新技術，探索肝癌和食管癌發生開展的分子機制，為惡性腫瘤等重大疾病早期診斷提供新技術和新方法。通過開展多學科交叉與綜合研究，形成具有原始創新的方法學突破及自主知識產權的蛋白質研究支撐平臺，獲得具有國際影響的重要研究成果，培養造就一支具有多學科知識和創新研究能力的研究隊伍，促進我國在蛋白質研究領域到達國際領先水平。五年預期目標：1.說明核酸適配體篩選過程的進化規律，建立針對蛋白質、細胞、組織等不同層次蛋白質靶標體系的高效率核酸適配體篩選技術平臺，并篩選出針對肝癌和食管癌特異性標志物的核酸適配體15-30種。2．揭示核酸適配體與蛋白質相互作用的分子機制，開展2-4種具有自主知識產權的系統研究核酸適配體分子識別的方法，為核酸適配體分子探針的設計、篩選、構/效關系和性能評價提供理論指導。3.開展高靈敏、高通量、高準確度的蛋白質定量檢測的新原理、新方法，提出高效率、高重現性的蛋白質別離富集的新方法、新技術，研制出相應高通量、自動化的蛋白質別離及檢測系統，對低豐度蛋白檢測的靈敏度到達1pg/mL及更低水平，為腫瘤的蛋白質生物標志物的發現、重大疾病的分子機制研究與早期診斷提供研究工具。4.建立肝癌、食管癌等惡性腫瘤體系的特征核酸適配體分子識別指紋圖譜，發現4-5種特異性高的癌癥標志物，并完成核酸適配體分子識別體系在癌癥早期診斷中的臨床意義評估,開發具有自主知識產權的診斷系統。5.取得有國際影響的重要根底研究成果，提出有自主知識產權的新理論和新方法。發表一批高水平、具有重要國際影響的學術論文。申請并獲得一批具有產業化前景的創造專利。6.在蛋白質研究領域培養一批具有化學與生物醫學交叉學科綜合知識的優秀人才隊伍與中青年研究骨干。通過工程協作，促進形成一支在核酸適配體相關領域具有國際領先水平的學術團隊。三、研究方案〔一〕總體思路〔1〕以腫瘤為研究模型，開展基于核酸適配體的蛋白質研究技術本工程從“國家中長期科學和技術開展規劃綱要〞中“人口與健康〞等國家重大戰略需求出發，以2023年度起蛋白質研究重大方案重要支持方向“蛋白質研究的新技術和新方法〞——“核酸適配體識別等新技術新方法〞為依據，發揮核酸適配體所具備的高特異性、高親和力、高穩定性、便于化學修飾與功能化、易于大量低本錢與可重復性合成等優勢，以及可通過核酸適配體篩選發現未知蛋白標志物并獲得病變體系特征分子圖譜的優越性，開展核酸適配體分子識別根底研究，指導蛋白質別離與檢測方法的設計與開展，建立高通量、高靈敏、高準確度的蛋白質研究新方法和新技術，為癌癥早期診斷提供特異性蛋白質標志物、分子探針、分子識別傳感器件，滿足提升我國人民健康水平的需求。〔2〕通過學科交叉，開展癌癥早期診治新方法隨著核酸適配體、納米生物探針、蛋白質組學研究方法的開展和成熟,核酸適配體技術在惡性腫瘤等重大疾病診治方面的應用正面臨新的機遇。利用我們在核酸適配體分子識別體系根底研究和蛋白質研究技術創新方面的優勢，通過多學科交叉,聯合國內的優勢單位組成跨學科的研究團隊〔包括化學、生物醫學、蛋白質科學、納米技術等學科〕，系統地開展基于核酸適配體的重大疾病蛋白質標志物發現與檢測技術的根底研究，利用核酸適配體分子識別體系進行癌癥等重大疾病的早期診斷，將核酸適配體分子識別體系在生物醫學領域的應用潛力變成現實。〔二〕技術路線：〔1〕核酸適配體篩選方法研究：構建大容量〔1013至1015〕的DNA和RNA分子文庫，通過對核苷的2’位修飾或對磷酸骨架進行硫代修飾等，改善文庫的生物穩定性。優化篩選條件與流程。對于的幾種肝癌和食道癌相關蛋白質〔如AFP、PIVKA-II、P53Ab〕，采用體外表達純化的蛋白質直接進行篩選，通過系統優化篩選壓力，獲得特異性高和親和力強的核酸適配體；同時為了發現未知蛋白質標志物，以肝癌和食道癌細胞、癌組織作為正篩選靶標，甄別對應非癌細胞系、癌旁組織等做陰性對照進行反向篩選，優化篩選條件與流程。對篩選出的核酸適配體進行測序、二級結構模擬分析、序列裁減，并表征其與靶標結合的親和力和特異性。通過針對大量不同樣本的系統篩選，發現核酸適配體篩選過程中的進化規律，建立高效、快速、標準化的篩選方法。〔2〕核酸適配體分子識別根底的研究：利用光譜技術、質譜技術、多維核磁共振和單分子探針技術揭示核酸適配體與靶蛋白質分子相互作用的構/效關系，深入研究生物分子識別規律。通過化學計算、分子模擬和分子設計，進行適配體與靶分子對接分析與自適應識別研究，建立相關理論模型，并利用這些模型和機制評估、設計新的核酸適配體分子探針，為建立基于核酸適配體的蛋白質研究新方法提供理論依據與指導。通過熒光標記與蛋白表達水平的同步檢測，鑒定不同蛋白質靶標交叉識別與同一蛋白質靶標重復識別的核酸適配體分子識別模式，初步篩選出具有分子指紋價值的核酸適配體探針。運用化學計量學與生物信息學方法，建立不同病變體系的核酸適配體特征分子識別圖譜的數學模型，通過大量樣品進行核酸適配體特征分子識別圖譜的評價與優化，通過特征提取算法進一步精簡模型的描述變量，最終確定具有重大疾病個性化診斷價值的核酸適配體。〔3〕基于核酸適配體的蛋白質定量檢測方法研究：基于上述篩選出來針對特定蛋白質分子的核酸適配體及其分子識別特性，設計構象互變型與鏈置換型熒光分子探針，開展均相、高通量的蛋白質定量檢測新方法。結合納米生物技術和核酸適配體分子識別特性，制備多種靈敏、簡便、經濟的核酸適配體分子探針，考察探針對靶分子或靶細胞的識別能力，研究其相互作用的動力學過程，開展改善探針靶向識別性能的方法，并建立納米探針凝集等蛋白質定量檢測新原理。綜合運用各種納米組裝手段，結合核酸適配體化學修飾與功能化方法，開展自組裝、原位沉積、物理插入、化學修飾等傳感界面固定化方法研究，開展外表密度與取向可控的核酸適配體探針的固定化技術。以微納米技術為根底，研究制作基于核酸適配體的微納米傳感器、微陣列的方法。探討傳感界面體系探針分子的負載量與仿生分子識別能力的關系，探索提高仿生分子識別體系納米傳感器、微傳感器、微陣列和微芯片系統的重現性與穩定性的方法，抑制復雜生物體系中的交叉干擾現象。在此根底上，研制壓電、阻抗、外表等離子共振等無標記型高靈敏、高通量、高精度蛋白質定量檢測新方法。〔4〕基于核酸適配體的蛋白質別離與富集方法研究：對篩選出的肝癌與食道癌相關低豐度蛋白的核酸適配體進行生物素、巰基、氨基等化學修飾，利用外表修飾親合素、羧基或環氧基的固相基質、納米金等固定核酸適配體，研究固相外表修飾核酸適配體的密度，通過理論與實驗分析其理論容量。通過鹽濃度、pH、溫度，變性劑等條件的調節，考察核酸適配體對蛋白的吸附、洗脫條件以及別離基質的再生方法，提高蛋白質富集與去除的重現性，由此建立批間誤差小、別離容量高的蛋白質富集與去除技術。對于樣品中高豐度蛋白質的去除，也將考察二氧化硅別離基質的制備，進一步提高高豐度蛋白質去除的容量與操作的簡便性。建立用于蛋白質別離與富集的微流控芯片技術，通過光刻法制備PDMS微流控芯片，通過在芯片上固定的核酸適配體與樣品混合物的循環流動進行低豐度蛋白質的富集捕獲。此外，通過篩選磷酸化、泛素化與糖基化等翻譯后修飾基團的核酸適配體，建立翻譯后修飾蛋白質組的捕獲與富集方法。〔5〕惡性腫瘤等重大疾病蛋白質標志物發現與驗證方法研究：從食管癌、肝癌的診斷入手，以12種食管鱗癌細胞系組成的細胞群、肝癌和食管癌病人的腫瘤組織標本等為正篩靶標，以正常細胞、癌旁組織為反篩樣本，篩選特異性核酸適配體。通過考察核酸適配體對大量食管癌、肝癌的細胞、組織及血清識別行為，系統評價所獲得的核酸適配體對惡性腫瘤的特異性。對于充分驗證的特異性核酸適配體，將其修飾于微流控芯片或微珠外表，并連續與癌細胞或組織裂解產物進行溫育以捕獲對應的蛋白質標志物。洗脫捕獲的蛋白質采用生物質譜技術進行鑒定，甄別相應的蛋白質標志物。對甄別出的蛋白質標志物，構建相關質粒，在細胞水平及動物模型中改變其表達，觀察其表達改變后對細胞生長及動物模型存活的影響，探討標志物分子在腫瘤發生中的作用，并以此發現與驗證癌癥發生、開展過程中的新型功能標志物及其表達與變化模式。此外，以核酸適配體探針結合分子成像與流式細胞分析技術，研究相關標志物在病變體系的分布、定位、及動態變化情況，進行標志物的直觀量化評估。〔6〕惡性腫瘤等重大疾病早期診斷方法與發生開展分子機制研究：利用工程所篩選的肝癌、食管癌核酸適配體，通過對大量早期腫瘤患者、健康對照人群進行血清樣本檢測，探討核酸適配體作為惡性腫瘤早期診斷指標的價值。利用不同亞型和分期的食管癌、肝癌病理標本檢測核酸適配體識別圖譜在腫瘤分型診斷中的臨床意義。結合納米生物技術，建立納米金、量子點、多孔納米材料、碳納米管和磁性納米粒子等納米材料界面核酸適配體的可控固定化方案，由此構建電、光、磁等功能化納米核酸適配體探針，建立基于這些分子探針的單個癌細胞的檢測方法和對病變組織的高靈敏成像方法，以期用于腫瘤早期診斷。利用生物探針和納米生物傳感器，開發基于液相芯片系統和金標-膜載體配合的核酸適配體快速診斷試劑和設備。通過質譜技術和蛋白質序列比對、結構功能預測以及樹狀分類分析等生物信息學手段分析與核酸適配體結合的蛋白質的結構和功能，研究腫瘤發生開展的機理。〔三〕創新點與特色本工程立足于工程組在化學、生物醫學、蛋白質科學、納米技術等方面良好的研究根底，結合工程組成員在核酸適配體、蛋白質研究和納米生物領域取得的重要進展，尤其是核酸適配體的細胞篩選法和基于核酸適配體的蛋白質別離與檢測方面的豐富積累，系統開展基于核酸適配體的蛋白質研究新技術與新方法的根底研究，具有以下多方面的創新性：1、核酸適配體篩選新方法方面：提出蛋白質分子、細胞、組織等多層次靶標的核酸適配體篩選與表征技術，通過核酸適配體的篩選實現正、負樣品蛋白質組的成分差減，與傳統的針對單一靶標的一次性篩選有本質的區別。本工程在大量篩選腫瘤相關核酸適配體的同時，系統地研究與說明核酸適配體篩選過程中的進化規律，從而建立高效、快速、標準化的篩選方法。這些新篩選方法將成為疾病診斷、分子機制研究與疾病標志物發現、鑒定的新的重要資源。2、蛋白質定量檢測新方法方面：利用核酸適配體易于修飾與標記的特性，將核酸適配體轉化為人工設計的多功能化生物分子探針。系統深入研究核酸適配體分子識別根底，闡述分子識別體系的構-效關系與相關的理論模型，指導基于核酸適配體的蛋白質檢測方法的理性設計。通過結合納米生物技術、核酸適配體的自適應機制、核酸適配體的特異性信號放大技術，為高靈敏、高通量、高選擇性的蛋白質檢測方法的建立提供機遇，促進蛋白質定量檢測新方法的重大突破。3、蛋白質別離新技術、新方法方面：針對翻譯后修飾蛋白質難以選擇性富集的難題，提出以糖基化、磷酸化、泛素化這類免疫原性很小的蛋白質翻譯后修飾基團為靶標篩選核酸適配體，以別離富集相關修飾蛋白；利用核酸適配體可規模化學合成、批間誤差小、本錢低、穩定性好的優勢，開展具有高容量、高精度的低豐度蛋白富集技術與高豐度蛋白的去除技術。這些新技術、新方法的開展，可望形成性能優良的蛋白質別離與富集技術平臺。4、在重大疾病蛋白質標志物發現新方法方面：通過開展針對癌細胞、組織的核酸適配體篩選新方法，將差異蛋白質組鑒別有效的嵌入在核酸篩選過程中，既防止了對大量蛋白質的平行定量分析，又解決了低豐度蛋白質標志物發現存在的檢測靈敏度低的難題，可望成為本工程自主創新的重大突破，成為重大疾病蛋白質標志物發現的重要技術手段。5、在惡性腫瘤等重大疾病早期診斷方面:提出以核酸適配體分子識別指紋圖譜作為腫瘤早期診斷、分型的方法，在腫瘤分型與腫瘤細胞的生物學特性間建立新的對應關系，為臨床治療方案確實立提供新依據。通過創新性地結合納米生物技術與核酸適配體分子工程技術，獲得一系列高靈敏、實時的生物檢測新方法與新器件，將為表達差異小、低豐度生物靶標的鑒定與研究提供關鍵的檢測技術與方法，可望在重大疾病的早期診斷方法學與技術根底方面取得創新性成果。本工程具有以下特色：〔1〕創新性強。面向國家需求開展癌癥等重大疾病早期診斷新方法，利用新的蛋白質識別技術，提出基于核酸適配體的系列蛋白質研究新技術與新方法。并以此為契機對核酸適配體篩選與識別中的根本科學問題進行系統的研究與闡述。〔2〕突出理論與應用的交叉。系統研究核酸適配體分子識別體系的識別規律，建立核酸適配體篩選的統計理論與模型，在理論層次上指導基于核酸適配體的蛋白質別離與檢測新技術與新方法的設計與應用。〔3〕研究內容覆蓋了生物、醫學、化學、蛋白質科學、納米技術等學科，表達了多學科交叉融合的特色。〔4〕工程組在核酸適配體篩選、蛋白質別離與檢測、惡性腫瘤早期診斷、生物傳感技術、納米生物分析技術等方面具備非常強的研究根底，優勢互補，為工程的高效率實施提供了保障。〔四〕可行性本工程根據設定的研究目標和內容，凝聚了一支來自國內主要優勢單位的多學科緊密配合的創新研究團隊，共有8個不同學科的國家重點實驗室或部門重點實驗室參與研究工作，研究條件互補性強，具備了開展本項研究的軟硬件條件。各參加單位在相關研究領域有長期的研究積累，而且已經合作開展了與本工程相關的前期研究工作,并取得具有國際影響的創新性成果。在核酸適配體篩選方法方面：主要承當單位湖南大學、中科院化學所和中國醫學科學院多年來在各種類型蛋白質體系的核酸適配體篩選等諸多方面積累了相當豐富的經驗，具有較強的綜合研究能力。譚蔚泓教授已經開展了系列的癌細胞特異性核酸適配體篩選與應用研究，具有重大的國際影響，近期他得到國家“千人方案〞的支持回湖南大學工作，與中科院化學所合作建成了核酸適配體篩選技術平臺，已成功篩選出白血病癌、肺癌、肝癌、丙肝病毒等特異結合的核酸適配體，發現了不同類型癌細胞具有不同的特征核酸適配體分子識別譜。中國醫學科學院開展了對腫瘤組織樣本的核酸適配體篩選初步工作。這些工作為本工程針對食管癌、肝癌樣品的核酸適配體篩選提供了理論與技術保障。在基于核酸適配體的蛋白質別離與定量檢測方法方面:湖南大學、中科院長春應用化學所、南京大學等主要承當單位都是長期從事蛋白質研究的國內優勢單位,在核酸適配體生物傳感技術、分子探針成像技術、納米生物技術、生物微陣列分析、微流控芯片技術等諸多方面具有很強的綜合研究能力。湖南大學在復雜多維數據分析、圖譜解析與專家系統、知識庫搜索與知識發現等化學計量學領域有很強的研究實力,曾獲得國家自然科學二等獎，為核酸適配體分子圖譜的解析及相關生物信息的發現與挖掘提供了理論與技術保障。中科院長春應用化學所、南京大學在核酸與蛋白界面組裝、納米技術、電化學、微電極系統方面研究成果豐碩，均曾獲得國家自然科學二等獎，為蛋白質研究新方法的突破奠定了堅實的根底。在基于核酸適配體的蛋白質標志物發現方法方面:主要承當單位之一的中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所是長期從事惡性腫瘤的根底與臨床研究的國內優勢單位,是一個醫療效勞輻射全國的大型腫瘤專科醫院，具有豐富的臨床資源，擁有豐富的癌組織、血清、癌細胞系儲藏，已獲得了相關疾病的多個重要標志物和蛋白質靶標，建立了靶向治療載體平臺技術與相關動物模型，成功研究了多種抗腫瘤疫苗與藥物。湖南大學譚蔚泓教授利用白血病篩選的核酸適配體，通過癌細胞特異性膜蛋白的富集與質譜分析，成功發現與鑒定相關癌細胞特異性膜蛋白標志物，相關成果連續在PNAS上發表，證明了本工程技術的可行性。通過本工程實施與多學科的交叉合作，可望為相關重大疾病標志物的發現提供新方法和技術平臺，具有取得原始創新的重要研究成果與自主知識產權的關鍵技術突破的可能。在基于核酸適配體的癌癥早期診斷方法方面：本工程一方面將核酸適配體技術與納米技術、生物傳感技術、分子成像技術等結合開展相關重大疾病個性化分子診斷新方法。另一方面，本工程提出將核酸適配體分子識別圖譜方法用于癌癥早期診斷與分子分型，這一自主創新的關鍵技術可在對惡性腫瘤等重大疾病蛋白質標志物、及腫瘤發生開展的分子機制尚不清楚的條件下，開展腫瘤特異性分子探針組，進而探索疾病發生、開展過程中蛋白質標志物的分子指紋與表達、變化模式，從而實現對應惡性腫瘤的個性化分子診斷與治療。此外，基于核酸適配體分子識別圖譜，也可以發現新的疾病標志物，進行新藥開發和病變分子機理的根底研究。在此意義上，本工程的實施將可望為重大疾病早期診斷以及發生、開展機制的研究開辟新途徑。總之，本工程給出的技術路線和研究思路充分考慮了原理與方法的可行性，既保證了創新性和預期成果的水平，又充分考慮了已有工作的根底，可保障研究目標的實現。因此，研究技術路線先進可行，已經具備了取得重大突破的條件。經過本工程的研究，可望在核酸適配體的篩選、蛋白質的別離與定量檢測新方法、惡性腫瘤的蛋白質標志物的發現、癌癥等重大疾病早期診斷等蛋白質研究的新技術與新方法方面取得重大突破。(五)課題設置本研究工程將以解決當前蛋白質研究中的瓶頸問題為總目標，圍繞四個關鍵科學問題，開展基于核酸適配體的蛋白質研究的新方法、新技術。根據核酸適配體技術根底、理論根底、關鍵方法學與應用三個方面的研究內容與預期目標，設置四個課題:課題1核酸適配體篩選新方法的根底研究課題2基于核酸適配體的蛋白質定量檢測新方法研究課題3基于核酸適配體的蛋白質別離與富集新技術研究課題4重大疾病蛋白質標志物發現的新方法研究如上圖所示，這些課題既相對獨立，又互相交叉。課題1是其它3個課題的根底，為課題2和課題3的實施提供理論指導與研究工具，也為課題4中蛋白質標志物發現提供新的技術依據和平臺；課題2和課題3在課題1的指導下，以課題4涉及的目標為對象，建立高靈敏、高選擇性、高通量的蛋白質別離與檢測新方法，提供技術平臺，并針對癌癥早期診斷這一應用出口進行驗證；課題4是課題1、2、3研究的外延與主要應用出口，主要開展蛋白質標志物發現的新方法與癌癥早期診斷的核酸適配體分子識別圖譜方法研究，該課題反過來也為課題1、2、3的實施提供物質根底。4個課題的研究成果可相互借鑒，同時課題2-4為課題1研究提供了驗證，而課題4研究過程中，有可能發現新的蛋白質標志物，也將納入到課題2、3中建立相關的別離與檢測的技術平臺。數個課題共同完成核酸適配體的分子識別機理、蛋白質別離與分析檢測方法、蛋白質標志物發現與癌癥早期診斷應用的研究。研究組成員通過聯合研究，協同公關，優勢互補，共同促進，有分工，有協作，表達了整體的團隊精神。課題1核酸適配體篩選新方法的根底研究參加單位：湖南大學，中國科學院化學研究所負責人：譚蔚泓教授學術骨干：俞汝勤院士，方曉紅教授，蔣健暉教授，李繼山副教授經費比例：28%研究目標：開展細胞、組織等不同多蛋白質復合靶標體系核酸適配體篩選方法，通過化學合成、目標篩選、分子裁減、功能化衍生等手段，設計、合成并篩選具有獨特優良性能的核酸適配體；研究這類復合體系核酸適配體的分子識別圖譜；說明核酸適配體的分子識別根底，為課題2與3中蛋白質定量檢測與別離新方法的研究提供指導。主要研究內容：1.核酸適配體文庫設計和篩選根底研究：合成含有20-60個隨機堿基長度的系列高質量DNA和RNA文庫；從隨機文庫中核酸結構的多樣性、不同核酸高級結構與靶標結合力的差異、核酸二級結構冗余性與PCR擴增效率的序列特異性三個方面，對篩選過程中影響核酸適配體富集的因素進行系統研究，分析篩選過程中核酸適配體的進化規律，以保證篩選過程中文庫結構的多樣性和配體的無偏擴增，實現基于配體與靶標親和力差異的核酸適配體高效進化。2.復合靶標體系核酸適配體篩選方法：以細胞、組織等靶標為重點，通過優化篩選條件與流程，開展針對不同生物靶標的標準化篩選方法，建立高效的活細胞、組織體系的核酸適配體篩選平臺。3.核酸適配體分子識別性質研究：建立表征核酸適配體分子與生物靶標結合性質的各種譜學研究方法，表征篩選出的核酸適配體與靶標結合的親和力和特異性，進行核酸適配體的二級結構分析和序列裁減；研究核酸適配體與靶標結合的構效關系，說明核酸適配體的分子識別機制。通過分子模擬，建立核酸適配體分子識別的理論模型，指導核酸適配體分子探針的設計。4.核酸適配體分子識別圖譜研究：根據核酸適配體篩選與表征的結果，構建核酸適配體分子探針組合，分析核酸適配體組對大量不同腫瘤樣品的分子識別圖譜，建立肝癌、食管癌的核酸適配體組的分子識別模式。結合大樣本的臨床評價，進一步研究核酸適配體特征分子識別圖譜用于相關腫瘤診斷的可行性，建立相關的診斷標準，探討核酸適配體特征分子識別指紋圖譜的早期診斷價值。課題2基于核酸適配體的蛋白質定量檢測新方法研究參加單位：中國科學院長春應用化學研究所,湖南大學,蘇州大學負責人：于聰教授學術骨干：董紹俊教授，劉莊教授，羊小海教授，聶舟副教授經費比例：23%研究目標：以課題1篩選的核酸適配體及其分子識別根底研究為依據，將納米技術、微陣列技術與核酸適配體技術相結合，引進高靈敏度的光、電、磁等傳感技術，建立核酸適配體在各類界面的可控修飾技術，開展高靈敏、高通量、高選擇性的蛋白質定量檢測方法與傳感器，并針對癌癥早期診斷應用開展蛋白質標志物檢測技術研究。主要研究內容：1．核酸適配體的功能化與分子探針的制備：研究不影響核酸適配體特異性的化學修飾、標記、與組裝方法，結合納米生物技術，制備靈敏、簡便、經濟的核酸適配體分子探針。2.基于核酸適配體的蛋白質檢測新原理與新方法：設計構象互變型與鏈置換型熒光分子探針，開展均相、高通量的蛋白質檢測新方法。利用核酸適配體修飾的納米雙色傳感顆粒、光-磁復合納米探針，開展細胞、組織、活體等水平的分子成像新原理與新方法，并開展癌癥早期診斷應用研究。3.基于核酸適配體的傳感器構建根底研究：利用核酸適配體分子識別原理，以微納技術為根底，綜合運用各種納米技術如自組裝、原位沉積、物理插入、化學修飾等傳感界面固定化方法，構建微納結構傳感界面，制作核酸適配體的微納傳感器、微陣列，并探索提高這些傳感體系修飾的重現性與穩定性的方法，研究微傳感結構界面仿生分子識別體系探針分子的負載量、空間取向與識別量的關系。4．基于核酸適配體的蛋白質傳感器技術：基于納米金、量子點、硅納米熒光粒子，介孔納米材料、碳納米管和磁性納米粒子等，開展用于高靈敏生物傳感的核酸適配體探針，基于核酸放大技術，開展微陣列檢測中基于光、電、磁信號傳導與放大的新方法；研制高靈敏的壓電、阻抗、可視、熒光及外表等離子共振等無標記的蛋白質傳感器，通過傳感器綜合優化，實現蛋白質的高通量、高靈敏、高選擇性檢測，并開展癌癥早期診斷應用研究。課題3基于核酸適配體的蛋白質別離與富集新技術研究參加單位：南京大學，中國醫學科學院，湖南大學負責人：許丹科教授學術骨干：練鴻振教授，張曉兵教授，余曉冬副教授，王小明副教授經費比例：22%研究目標：以課題1篩選的核酸適配體及其分子識別根底研究為依據，建立以微流控學與微納米別離為根底的生物親和別離技術；建立高容量、自動化、高度重復性的低豐度蛋白質的高效富集方法以及高豐度蛋白的無偏去除方法；通過泛素化、磷酸化、糖基化等翻譯后修飾基團的核酸適配體，建立相關翻譯后修飾蛋白組的選擇性富集方法。同時，針對癌癥早期診斷應用開展蛋白質標志物別離與鑒定技術研究。主要研究內容：1．微納米載體上核酸適配體負載技術：通過核酸適配體末端的生物素、巰基、氨基等化學修飾基團，利用微珠外表修飾親合素、納米金與羧基，開展對應的微納米載體外表核酸適配體的固定技術。研究微球外表的核酸適配體的修飾密度，通過理論與實驗分析其理論容量。2.蛋白質微納米別離技術：通過負載核酸適配體的微納米顆粒，建立高豐度蛋白去除、低豐度蛋白富集的磁別離、離心別離、超濾別離、柱別離等技術。通過鹽濃度、pH、溫度、變性劑等條件的調節，考察核酸適配體吸附蛋白的洗脫與微珠的再生條件，研究提高蛋白質富集與去除的重現性的方法。3．蛋白質富集的微流控芯片技術：制備PDMS的微流控芯片，通過在芯片上核酸適配體的固定與樣品混合物的循環流動進行低豐度的蛋白質富集捕獲。優化流路尺寸、核酸適配體固定模式，研究流路與流體控制對富集捕獲效率的影響，實現低豐度蛋白質的高效率、自動化的富集，并開展癌癥早期診斷應用研究。4.蛋白質翻譯后修飾的捕獲富集技術：針對蛋白質磷酸化、泛素化、糖基化等免疫原性很低的翻譯后修飾，設計磷酸化氨基酸、泛素與糖分子等靶分子體系，篩選翻譯后修飾基團的核酸適配體，結合微流控學與微納米別離技術，建立翻譯后修飾蛋白組的捕獲與富集方法。課題4重大疾病蛋白質標志物的發現新方法研究參加單位：中國醫學科學院，蘇州大學，中國科學院化學研究所負責人：馬潔研究員學術骨干：宋詠梅副研究員，王成鋒主任醫師，劉祥軍副研究員，彭睿副教授經費比例：27%研究目標：以課題1、2、3的核酸適配體篩選及蛋白質別離與檢測新方法為依據，篩選針對肝癌、食管癌的特異性核酸適配體分子，建立基于核酸適配體的肝癌、食管癌蛋白質標志物發現與甄別技術；同時，針對癌癥早期診斷應用，建立用于腫瘤早期診斷和分型診斷的核酸適配體分子識別圖譜，并為惡性腫瘤發生開展機制的研究提供新技術。主要研究內容：1.不同來源腫瘤樣本特異性核酸適配體圖譜篩選：以食管癌、肝癌為例，利用細胞、組織等復合靶標以及相應的對照樣品，篩選腫瘤特異性的核酸適配體分子。2．蛋白質標志物的發現與驗證：通過與病變體系特征的蛋白質標志物對應的核酸適配體別離與富集蛋白質標志物，并利用質譜與核磁譜技術鑒定相關的蛋白標志物。同時，利用基于核酸適配體的分子成像技術與流式細胞技術，開展標志物驗證研究。3.食管癌、肝癌的早期診斷和分型診斷：對大量早期食管癌、肝癌患者、健康對照人群血清樣本檢測，結合臨床病歷資料，探討特異性核酸適配體作為惡性腫瘤早期診斷指標的價值。利用不同亞型和分期的食管癌、肝癌病理標本檢測核酸適配體分子識別圖譜在腫瘤分型診斷中的臨床意義。將適用于分型診斷的核酸適配體用于血清樣本的檢測，評估其在早期惡性腫瘤患者分型診斷中的意義。4.腫瘤發生開展的機制研究：以裸鼠為宿主，建立食管癌、肝癌裸鼠移植瘤模型，將癌細胞懸液皮下種植于裸鼠背部，待腫瘤生長一定體積后用于實驗。利用活體成像方法考察所開展的核酸適配體探針對裸鼠接種成瘤后癌細胞的識別能力，通過在體、解剖和離體研究手段，考察腫瘤在裸鼠體內各臟器的分布及其隨時間的變化情況，揭示腫瘤發生開展的分子機制。四、年度方案研究內容預期目標第一年系列DNA或RNA文庫的合成；針對肝癌、食道癌相關蛋白的核酸適配體的初步篩選；肝癌食道癌細胞系、組織樣品以及反篩選樣品的制備。針對肝癌、食道癌細胞的核酸適配體初步篩選。以核酸適配體的分子識別效應與構象變化效應為根底，結合納米生物技術，研究核酸適配體的非共價標記技術。探索基于各類集聚效應的信號傳導新技術。開展適配體在微納別離材料外表組裝性質的研究，開展對應的微納米載體外表核酸適配體的固定技術，開展適配體核酸堿基及分子結構的改造研究，系統研究多種固定載體與適配體仿生界面制備的規律；開展磁性微納顆粒別離技術和新型適配體負載微納米粒子材料的研究。開展通過細胞或組織篩選進行高通量的蛋白質標志物發現的新方法設計與合成5個DNA或RNA文庫；初步富集到可識別肝癌、食道癌相關蛋白的核酸適配體庫一個；初步富集到可識別肝癌、食道癌細胞的核酸適配庫2個。構建基于非共價標記的核酸適配體分子探針。實現適配體在微納材料外表的高效結合，為適配體仿生識別界面的建立提供理論指導和有效方法。建立快速、高效的磁性別離平臺，建立低豐度蛋白的快速富集與檢測技術。建立基于核酸適配體的蛋白標志物富集與鑒定方法。第二年克隆與表征特異性識別肝癌、食道癌相關蛋白及癌細胞的核酸適配體，進行結構分析與冗余序列的剪裁，進行識別機理的研究；進一步篩選針對肝癌、食道癌組織和血清樣品的核酸適配體。進一步開展以納米材料為依托的非標記核酸適配體傳感技術，以小分子探針的集聚效應等為根底，開展基于核酸適配體的蛋白質檢測新方法。探索基于光、電、磁的高效響應信號傳導、放大新方法。開展適配體微流控芯片的研究，研究流路與流體控制對富集捕獲效率的影響。開展適配體親和色譜柱的研究，以篩選出的新適配體為親和識別分子，開展適配體親和電泳/色譜別離方法的研究。開展適配體微納米材料別離細胞的研究。通過考察核酸適配體對大量食管癌、肝癌的細胞、組織及血清識別行為，系統評價所獲得的核酸適配體對惡性腫瘤的特異性。將課題一篩選得到的核酸適配體用于食管癌、肝癌等蛋白標志物的發現。獲得2-3種特異性識別肝癌、食道癌相關蛋白核酸適配體；獲得3-4種特異性識別肝癌或食道癌細胞和組織的核酸適配體。利用核酸適配體與靶蛋白結合時的構象互變性質，開展非標記的蛋白質核酸適配體分析方法。利用熒光納米顆粒等納米材料具有穩定性好、信號強度高等優點，構建核酸適配體熒光探針，以解決微量蛋白質檢測時高靈敏信號的獲取問題。制備出適配體修飾的微流控芯片，實現低豐度蛋白質的自動化富集功能。研制可供蛋白質富集或去除的親和色譜柱。建立基于適配體輔助別離與檢測的蛋白質分析新方法。驗證所獲得的核酸適配體對肝癌、食管癌的特異性。發現一批食管癌、肝癌等蛋白標志物。第三年克隆與表征特異性識別肝癌、食道癌組織和血清的核酸適配體，進行結構分析與冗余序列的剪裁，進行識別機理的研究；對不同層次的核酸適配體篩選方法進行優化與總結，建立相應的標準化篩選平臺；探討核酸適配體的富集規律以及核酸適配體的分子識別機理。開展多種基于核酸適配體的蛋白質靈敏、方便的檢測分析新技術。利用小分子探針、電化學阻抗、熒光共軛聚合物等開展基于適配體的傳感器構建根底研究。利用各種信號放大技術開展基于適配體的蛋白質分析響應信號放大技術。研究不影響核酸適配體特異性識別功能的化學修飾與標記技術。開展適配體磁性顆粒對高豐度蛋白的去除研究；建立篩選針對磷酸化氨基酸、泛素與糖分子等靶分子的適配體篩選體系；開展適配體富集與別離多個腫瘤標志物的研究；開展肝癌與食道癌相關低豐度蛋白的核酸適配體別離與檢測研究。結合質譜、核磁等蛋白質分析技術進行相關蛋白組的鑒定。獲得3-4種特異性識別肝癌或食道癌細胞和組織的核酸適配體；建立蛋白、細胞組織篩選的三個層次的核酸適配體篩選平臺；為其他課題提供核酸適配體以及高效率的篩選平臺。開展無須別離直接在均相溶液中靈敏、快速、實時地檢測混合組分中靶標的信號核酸適配體。制備靈敏、簡便、經濟的核酸適配體分子探針。建立高豐度蛋白質去除的別離最正確條件；篩選出翻譯后修飾蛋白質修飾分子的適配體；實現適配體多個標志物蛋白質別離富集的功能。驗證發現的食管癌、肝癌等蛋白標志物。第四年進一步克隆、表征篩選得到核酸適配體，并進行相關的結構與識別機理的研究；考察所篩選的核酸適配體對不同肝癌和食道癌的識別特異性，初步構建核酸適配體組；開展肝癌與食道癌的核酸適配體識別指紋譜的初步研究。深入研究各種響應信號的傳導與放大技術，提高核酸適配體傳感器的抗干擾能力，開展基于邏輯門技術、微陣列技術、外表等離子體共振等的核酸適配體高靈敏、高特異性生物傳感技術。結合翻譯后修飾蛋白質修飾分子適配體篩選成果，研究對修飾蛋白質的富集別離；以微流控芯片為別離平臺，研究多流路高通量適配體親和別離方法和材料，探索研究基于蛋白質靶標的腫瘤細胞微流控分析技術平臺。研究腫瘤發生開展的機制研究。獲得8-20種特異性識別肝癌、食道癌相關蛋白、細胞、組織和血清的核酸適配體；考察5-10種識別肝癌的核酸適配體對不同肝癌的識別特異性，構建肝癌識別的核酸適配體組；考察5-10種識別食道癌的核酸適配體對不同食道癌的識別特異性，構建肝癌識別的核酸適配體組。制備高靈敏、高選擇性、抗干擾能力強的核酸適配體蛋白質傳感器。研制應用于修飾蛋白質富集的微納米顆粒，實現無偏型蛋白質富集與別離；以微流控芯片為別離平臺，建立腫瘤細胞微流控分析技術平臺。利用動物模型研究腫瘤發生開展的機制。第五年開展肝癌與食道癌的核酸適配體識別指紋圖譜的研究，課題4合作建立不同病變體系的核酸適配體特征分子識別圖譜，通過對大量樣品進行核酸適配體特征分子識別圖譜的評價與優化，通過特征提取算法進一步精簡模型的描述變量，最終確定具有肝癌或食道癌的個性化診斷價值的核酸適配體組合以及識別模型。進一步提高適配體傳感器的抗干擾能力，努力實現實際生物、臨床樣品的檢測和分析。采用篩選出的核酸適配體實現對修飾蛋白質的共性富集，結合微流控學與微納米別離技術，建立翻譯后修飾蛋白組的捕獲與富集方法。利用臨床大樣本對大量早期食管癌、肝癌患者、健康對照人群的血清樣本進行檢測，結合臨床病歷資料，探討核酸適配體作為惡性腫瘤早期診斷指標的價值。完善針對肝癌和食道癌的核酸適配體組；分別建立針對不同肝癌和食道癌的核酸適配體識別指紋圖譜庫；初步建立具有肝癌或食道癌的個性化診斷價值的核酸適配體識別模型。以血清學檢驗為目標，建立蛋白質高靈敏、高通量檢測的生物傳感新技術，并用于生物、臨床樣品的檢測和分析。實現無偏性適配體的蛋白質組學應用研究，探索適配體在蛋白質磷酸化、泛素化與糖基化功能研究中的作用；建立具有共性化富集與個性化檢測的新方法。完成核酸適配體分子識別體系在癌癥早期診斷中的臨床意義評估。一、研究內容本工程將主要進行以下四方面研究：核酸適配體篩選新方法的根底研究；基于核酸適配體的蛋白質分析檢測技術研究；基于核酸適配體的蛋白質別離與富集新技術研