雙熒光素酶報告基因檢測（二）雙熒光素酶實驗通常被用來評估miRNA是否與其潛在的靶基因發生相互作用。實驗中，預測的miRNA靶標基因的3’-UTR序列被克隆到含有螢火蟲熒光素酶的報告基因載體的3’-UTR位置。如果miRNA與插入到質粒中的目標序列發生結合，miRNA將通過抑制該序列的翻譯來降低螢火蟲熒光素酶的表達，進而導致熒光強度的下降。這一變化可以作為miRNA與靶基因結合的指標。miRNA簡介microRNA（miRNA）是一類長度在22nt左右的小RNA分子，它并不編碼蛋白質，因此miRNA與siRNA和circRNA等小RNA分子一樣，也是一種非編碼RNA。通過參與調節其下游基因翻譯過程面發揮其生物學功能。miRNA的功能機制與siRNA相似，主要通過與靶RNA的堿基形成互補配對，從而導致RNA誘導的沉默復合體（RISC）介導的RNA降解或阻止mRNA被翻譯成蛋白。區別在于，miRNA通常與mRNA的3'UTR區域發生結合。miRNA與靶基因的作用機制通過將miRNA靶基因的結合位點構建到熒光素酶報告載體系統里，同時和miRNA寡核苷酸轉染，觀察熒光的強度變化，來判斷miRNA是否作用了靶基因。miRNA的基本作用機制有兩種：1.抑制蛋白翻譯miRNA能以4種不同的方式抑制蛋白質表達：(1)使正在翻譯的蛋白發生降解；(2)抑制翻譯延伸；(3)使翻譯過早終止（使核糖體從RNA上提早掉下來，沒法行使翻譯功能）；(4)抑制翻譯起始。2.通過不完全的miRNA-mRNA互補配對誘導靶RNA降解。由于miRNA的作用機制是比較復雜的，所以我們在檢測miRNA作用的時候，不光要檢測一下它的靶基因的RNA水平的表達，還要檢測一下靶基因的蛋白表達。圖1載體構造與miRNA與靶基因的作用機制(DOI：10.3892/or.2018.6944)miRNA與靶基因的作用實驗步驟通過實驗原理我們知道對于miRNA靶基因驗證實驗我們需要構建的轉染工具有：（1）對于miRNA有miRNA對照組（miRNA-NC）和miRNA過表達（miRNA）；（2）對于靶基因的3’UTR有3’UTR空載對照組（3’UTR-NC），3’UTR野生型（3’UTR-WT），3’UTR突變型（3’UTR-Mut）。一般是按照如下分為六組（已用序號標明）。1.microRNA靶點的預測利用Targetscan,miRDB,PicTar軟件預測靶基因3’UTR與microRNA的結合位點。2.構建含靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體根據軟件預測的靶基因3’UTR與microRNA的結合位點，設計引物PCR擴增靶基因3’UTR序列，或直接進行基因合成，再插入到雙熒光素酶報告基因載體上。3.microRNAmimics和microRNAnegativecontrol的合成合成相應的microRNAmimics和microRNAnegativecontrol.4.細胞轉染準備將靶基因3’UTR的雙熒光素酶報告基因載體和microRNAmimics或microRNAnegativecontrol共轉染293T或Hela細胞。5.熒光素酶檢測共轉染細胞24-72h后，進行雙熒光素酶檢測，確定目的microRNA的靶基因。卡梅德生物（KMDBioscience）(/)建立了完善的細胞培養平臺，能夠提供給客戶多種細胞學基礎實驗，可以提供優質的免疫檢測服務—雙熒光素酶標記基因檢測。我們從以下案例來分析：案例我們以MicroRNA-1269binhibitsgastriccancerdevelopmentthroughregulatingmethyltransferase-like3(METTL3)來分析。MicroRNA（miRNA）表達失調與許多腫瘤的進展有關，據報道，miR-1269b的異常表達在某些癌癥的進展中起著關鍵作用，研究旨在研究miR-1269b在胃癌（GC）進展中的作用及其隱藏機制。METTL3是GC細胞中miR-1269b的下游靶標，通過StarBase在線分析數據庫(/)，發現miR-1269b和METTL3mRNA3-UTR之間存在結合位點（圖3A）雙熒光素酶報告分析強調miR-1269b過表達可以降低293T細胞中METTL3-WT的螢光素酶活性，但METTL3-MUT的表達沒有受到顯著影響，qRT-PCR和Western印跡表明，與對照（miR-NC或miR-in）相比，miR-1269b過表達顯著降低了NCI-N87細胞中METTL3mRNA和蛋白質的表達，而miR-1269b抑制劑轉染SNU-16細胞的作用相反（圖3C和D）。通過qRT-PCR，我們還發現METTL3在GC組織中的表達明顯高于鄰近組織（圖3E）。相關性分析強調，miR-1269b的表達與GC組織中METTL3mRNA的表達呈負相關（圖3F）。上述結果表明，miR1269b可以靶向METTL3mRNA3-UTR，并負調控GC細胞中METTL3的表達。Fig.1METTL3isthetargetofmiR-1269bA)ThepredictedbindingsequencebetweenMETTL3mRNA3UTRandmiR-1269b.(b)Dual-luciferasereportergeneassaywasusedtoverifythebindingrelationshipbetweenMETLL3mRNA3UTRandmiR-1269b.(c)and(d)qRT-PCRandWesternblotwereusedtodetecttheexpressionofMETTL3mRNAandproteininNCI-N87andSNU-16cellstransfectedwithmiR-1269bmimicsorinhibitors.(e)qRT-PCRwasusedtodetecttheexpressionofMETTL3mRNAinGCtissuesandadjacenttissues.(f)PearsoncorrelationwasusedtoanalyzethecorrelationbetweenMETTL3mRNAexpressionandmiR-1269bexpressioninGCtissues.**P<0.01,and***P<0.0這張圖片主要內容為驗證miR-1269b和靶基因METTL3互作。圖a：StarBase進行生物信息學分析靶基因的3’-UTR區序列是否有miRNA結合位點；圖b：雙熒光素酶報告基因實驗；圖c和d：qRT-PCR和WB檢測miR-1269b對靶基因METTL3mRNA和蛋白表達水平的影響；圖f：相關性分析miRNA-1269b和靶基因METTL3之間的關系。接著，我們又對以下的文獻進行分析，Hepatocyte-specificsuppressionofmicroRNA-221-3pmitigatesliverfibrosis，主要為miR-221-3p結合Gnai基因3’UTR區調節HSCs細胞活化影響肝纖維化。miR-221-3p通過GNAI2抑制了HSCs的激活，慢性肝損傷期間，阻斷肝細胞中的miRNA-221-3p功能有助于肝臟的恢復和更快地解決細胞外基質的沉積問題。此外，作者證明，miRNA-221-3p對GNAI2具有轉錄后調控作用，導致C–Cmotif趨化因子配體2的分泌減少，從而減輕了肝纖維化。miRNA-221-3p的抑制可作為治療肝纖維化的治療方法之一。通過生物信息學分析以及相關軟件預測，獲得miR-221-3p可能的靶向基因Gnai2（A）。WB和qPCR結果顯示，與健康組相比GNAI2的表達水平較低（B)，與Control相比，AAVTud組GNAI2表達水平提高（C，D），這可能與miR-221-3p的上調有關。之后用miR-221-3pmimics處理正常肝細胞，結果顯示，與陰性對照組相比，miR-221-3pmimics處理組的GNAI2表達水平顯著降低（E）。雙熒光素酶實驗結果進一步證明了miR-221-3pmimics直接靶向Gnai2的3’UTR。綜上，作者證明miR-221-3p直接參與Gnai2的轉錄后調控。Fig.1Gnai2isanoveltargetgeneofmiR-221-3p.(A)A30UTRsequenceofGnai2targetedbymiR-221-3p.(B)GNAI2issignificantlydownregulatedinprimaryhepatocytesisolatedfromfibroticlivertissuesinvivo.AAVTuDinjectionleadstoupregulationofGnai2(C)mRNAand(D)proteinlevelsinisolatedprimaryhepatocytes(n=7mice/group).(E)TransfectionofmiR-221-3pmimicinprimaryhepatocytesleadstoadecreaseinGNAI2proteinlevelscomparedwithrespectivescramblecontrol(n=5).(F)DualluciferasereporterassayshowsthatmiR-221-3pdirectlybindsto30UTRofGnai2,suggestingthatGnai2isadirecttargetofmiR-221-3p.Dataareshownasfoldchangeandcomparedwiththecontrolgroupsetas1.Errorbarsrepresent±SEM.One-wayANOVAwasusedforstatistic