苦蕎麥黃酮對(duì)糖尿病大鼠神經(jīng)功能的影響

苦蕎麥（l.）是蓼科的一種植物。根據(jù)現(xiàn)代本草綱目，苦蕎麥具有苦、平、寒、益氣、連續(xù)精神、益眼、理氣、寬腸、健胃的作用。現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)觀察表明,苦蕎麥籽粒、根、莖、葉及花中均含有較多的槲皮素、蘆丁、山奈酚-3-蕓香糖甙和槲皮素-3-葡萄糖蕓香糖甙等黃酮類化合物。苦蕎麥粉及其制品具有降血糖、降血脂,抗氧化和清除自由基等多種生理活性。對(duì)糖尿病、高血壓、高血脂、冠心病等病都有較好治療作用。而這些活性可能與其改善神經(jīng)功能有關(guān),筆者擬探討苦蕎麥黃酮對(duì)糖尿病模型動(dòng)物神經(jīng)功能的影響。1材料表面1.1測(cè)試對(duì)象苦蕎麥黃酮(由沈陽(yáng)藥科大學(xué)提供,批號(hào):20000518),用蒸餾水溶解供試;地塞米松注射液(沈陽(yáng)第一制藥廠,批號(hào):030821)。1.2動(dòng)物照明照明選擇180~220g的Wistar大鼠,7~8周,雌雄各半,由沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分組后置于溫度18~29℃,相對(duì)濕度50%~70%,40W日光燈照明,每日早8時(shí)到晚8時(shí)光照,每5只大鼠一籠群養(yǎng),動(dòng)物自由攝食,飲水。適應(yīng)上述環(huán)境一周后用于實(shí)驗(yàn)。1.3試劑和試劑盒導(dǎo)升明(Doxium,由奧地利依比威公司提供),鏈脲佐菌素(Streptozotocin,Sigma.ChemicalCo.美國(guó)Lot100K1677),哇巴因(SigmaChemicalCo.Lot30K1207),腺嘌呤核苷三磷酸二鈉鹽(中國(guó)科學(xué)院上海神經(jīng)化學(xué)研究所,批號(hào):8903067),戊巴比妥鈉(上海行知化工廠,批號(hào):921019),吡啶(由沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠提供),無(wú)水乙醇(沈陽(yáng)第一試劑廠,批號(hào):2000022301),ADP(上海生物化學(xué)研究所,批號(hào):20000818),ATP酶試劑盒(南京建成生物研究所,批號(hào):20040315),LA試劑盒(南京建成生物研究所,批號(hào):20040423),CK試劑盒(南京建成生物研究所,批號(hào):20040423),水合氯醛(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司,批號(hào):20030227),三氯醋酸(沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠,批號(hào):20000712),氯化鈉(沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠,批號(hào):200309011),鹽酸(沈陽(yáng)化學(xué)試劑廠,批號(hào):200311011),正丁醇(天津市博迪化工有限公司,批號(hào):031203),DNTB(Fluka化學(xué)試劑公司提供,批號(hào):023K3744),磷酸二氫鉀(汕頭市金砂化工廠生產(chǎn),批號(hào):930505),磷酸氫二鉀(沈陽(yáng)市試劑一廠,批號(hào):930505),血糖試劑盒(保定長(zhǎng)城臨床試劑公司,批號(hào):20031005)。1.4儀器、試劑和儀器721分光光度計(jì)(山東高密分析儀器廠),PcLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(北京微信斯達(dá)有限公司提供),PF3多普勒血流儀(瑞典PerimedPerifluxCo.IMX),自動(dòng)免疫分析儀(美國(guó)雅培公司),FA·JA系列電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司),TGL-16C臺(tái)式高速離心機(jī)(江蘇環(huán)保儀器廠),YKH-Ⅱ液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠),H.H.S21-4電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠),TN-100B型托盤式扭力天平(上海第二天平儀器廠)。2方法2.1分組及給藥情況觀察取大鼠,測(cè)定其血糖。從雌性大鼠中隨機(jī)取出5只,雄性大鼠中隨機(jī)取出5只作為正常對(duì)照,其余動(dòng)物禁食12h后,腹腔注射(ip)STZ生理鹽水溶液65mg/kg(無(wú)菌生理鹽水臨用時(shí)現(xiàn)配),給藥體積為1mL/100g,造糖尿病模型。給予鏈脲佐菌素后24h內(nèi),動(dòng)物飲用葡萄糖水,然后自由攝食飲水,72h后測(cè)定大鼠空腹血糖,血糖大于16mmol/L的動(dòng)物入選。選出大鼠50只參加實(shí)驗(yàn),測(cè)定大鼠血糖。并按大鼠血糖和體重隨機(jī)分組,分組及處理情況見(jiàn)表1。連續(xù)給藥3個(gè)月,給藥期間,觀察動(dòng)物的體重、攝食、飲水的變化及排泄等情況。給藥結(jié)束時(shí),測(cè)定各組大鼠血糖、神經(jīng)血流量、腦GSH及Na+-K+-ATP酶的含量。2.2分光光度計(jì)劃法大鼠眼眶靜脈叢取血,離心分離血清。測(cè)定時(shí)吸取血清10μL,加入葡萄糖氧化酶酚混合試劑1.5mL,混勻后置37℃水浴保溫15min,用分光光度計(jì)在505nm處比色。同時(shí),取蒸餾水和標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液作對(duì)照,與樣品平行實(shí)驗(yàn),用空白管調(diào)零,分別讀取各管光密度。樣品管吸光度與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度比較,計(jì)算樣品中葡萄糖含量[血糖(mmol/L)=(樣品管吸光度·標(biāo)準(zhǔn)管吸光度)×5.55]。2.3坐骨神經(jīng)干內(nèi)的血流量測(cè)定用35mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠,分離左腿坐骨神經(jīng),將神經(jīng)嵌入塑料凹槽中,在月國(guó)窩上1cm處,用多普勒血流儀測(cè)定暴露的坐骨神經(jīng)干內(nèi)的血流量。連續(xù)記錄10次血流量的變化,取其平均值作為該大鼠的神經(jīng)血流量數(shù)值。2.4dntb試液的制備將大鼠斷頭處死,取腦0.2g在冰浴中,以0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)和0.8mL的10%三氯乙酸制成10%勻漿,室溫下4000rpm離心15min,分離上清液0.5mL,加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)4.5mL稀釋,加入0.4g/L的DNTB試液0.02mL,混勻。以不加腦勻漿的對(duì)照管調(diào)零,5min后,用721分光光度計(jì)412nm波長(zhǎng)處比色,吸光度值除以腦重得出每克腦組織的谷胱甘肽含量。2.5u3000定型劑將大鼠斷頭處死,取腦,以0.2mmol/L蔗糖及0.02mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)制成勻漿,直接用粗制勻漿加入酶反應(yīng)管中。反應(yīng)液中各化合物的濃度為:NaCl(100mmol/L),MgCl2(2.5mmol/L),KCl(10mmol/L),EDTA(2.0mmol/L),ATPNa2(1.0mmol/L)或哇巴因(0.2mmol/L)。37℃水浴中反應(yīng)30min后速加無(wú)機(jī)磷顯色劑2.5mL(含0.02%孔雀綠、0.55%鉬酸銨及0.1%吐溫20),再加2.4%檸檬酸鈉0.2mL,室溫反應(yīng)30min,721分光光度計(jì)660nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,計(jì)算無(wú)機(jī)磷含量,Na+-K+-ATP酶活性為不含哇巴因與含哇巴因兩管之差值,除以腦重得出每克腦組織所含的Na+-K+-ATP酶活力單位。2.6神經(jīng)擾動(dòng)測(cè)試應(yīng)用Pclab生物信號(hào)采集系統(tǒng),顯示模式為記憶示波,采樣間隔為25μs,選擇1、2、4采樣通道,刺激器觸發(fā)。第1、2通道連接輸入電極,設(shè)置為原通帶,刺激電極連接“刺激輸出”插口,輸出位置處于AC(交流電)狀態(tài)。將大鼠用0.35%戊巴比妥鈉麻醉后固定,在接近尾根部處安置一對(duì)刺激電極,并在尾部遠(yuǎn)心端和近心端各安置一對(duì)輸入電極,測(cè)量?jī)蓪?duì)輸入電極之間的距離,采用Pclab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)給刺激電極施加一電刺激信號(hào)(電壓1V,波寬0.1ms),1、2通道可記錄神經(jīng)干動(dòng)作電位波形,4通道可記錄刺激波形,由此可計(jì)算神經(jīng)沖動(dòng)從近心端電極傳到遠(yuǎn)心端電極所需的時(shí)間。重復(fù)電刺激3次,每次間隔1min,取平均值,按下式計(jì)算其傳導(dǎo)速度:傳導(dǎo)速度(m/s)=電極距離(cm)×10?2傳導(dǎo)時(shí)間(ms)×10?3(m/s)=電極距離(cm)×10-2傳導(dǎo)時(shí)間(ms)×10-33結(jié)果3.1苦蕎麥黃酮對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響實(shí)驗(yàn)表明,鏈脲佐菌素造型后,大鼠血糖明顯升高,與正常動(dòng)物的血糖水平比較有顯著差異。苦蕎麥黃酮以40~80mg/kg劑量給動(dòng)物灌胃,糖尿病動(dòng)物的血糖在苦蕎麥黃酮組顯著下降,和模型組比較,血糖分別降低11%、15%,苦蕎麥黃酮給予的各組動(dòng)物血糖進(jìn)行給藥前后比較,均有顯著差異,苦蕎麥黃酮各組動(dòng)物血糖的前后比較,分別降低11%、21%和25%,提示苦蕎麥黃酮對(duì)高血糖動(dòng)物的血糖具有調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)表2。3.2苦蕎麥黃酮對(duì)大鼠尾神經(jīng)傳導(dǎo)的影響鏈脲佐菌素造型后,大鼠尾運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度較正常對(duì)照組顯著降低,苦蕎麥黃酮以20~80mg/kg劑量給動(dòng)物灌胃,糖尿病動(dòng)物的尾神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著提高,甚至恢復(fù)到接近正常動(dòng)物水平。見(jiàn)表3。3.3苦蕎麥黃酮對(duì)大鼠gsh的影響鏈脲佐菌素糖尿病大鼠末次給藥后次日,取大鼠端腦測(cè)定各組大鼠谷胱甘肽(GSH)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,糖尿病模型大鼠GSH含量明顯減少,苦蕎麥黃酮80、40、20mg/kg3個(gè)劑量均可顯著增加糖尿病大鼠GSH含量,且呈一定的劑量反應(yīng)關(guān)系(結(jié)果見(jiàn)表4)。導(dǎo)升明亦可阻止GSH的降低。3.4糖尿病大鼠na+-k+-atp酶活力變化鏈脲佐菌素糖尿病大鼠末次給藥后次日,取大鼠右側(cè)皮質(zhì)測(cè)定Na+-K+-ATP酶含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:糖尿病模型大鼠Na+-K+-ATP酶含量明顯減少,苦蕎麥黃酮80、40、20mg/kg。三個(gè)劑量均可顯著增加糖尿病大鼠Na+-K+-ATP酶活力,且呈一定的劑量反應(yīng)關(guān)系。導(dǎo)升明亦可抑制Na+-K+-ATP酶的降低(結(jié)果見(jiàn)表5)。3.5神經(jīng)血流量的檢測(cè)鏈脲佐菌素選擇性破壞胰島β細(xì)胞,導(dǎo)致血糖升高,進(jìn)而,引起細(xì)胞內(nèi)山梨醇升高,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白糖基化,許多酶的結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)改變,這種情況發(fā)生在血管壁,將導(dǎo)致血管上皮細(xì)胞壞死,基底膜增厚,導(dǎo)致組織細(xì)胞供血供氧障礙。鏈脲佐菌素造成糖尿病后,神經(jīng)組織的供血減少,用多普勒血流儀測(cè)定坐骨神經(jīng)干內(nèi)的血流量,記錄瞬時(shí)血流量的變化,取其平均值作為每只動(dòng)物的血流量數(shù)據(jù),再經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理計(jì)算神經(jīng)血流量。測(cè)定結(jié)果表明:鏈脲佐菌素糖尿病模型大鼠坐骨神經(jīng)血流量明顯減少,苦蕎麥黃酮80、40、20mg/kg三個(gè)劑量均可顯著增加神經(jīng)血流量,高劑量組甚至達(dá)到正常大鼠水平(見(jiàn)表6)。4苦蕎黃酮對(duì)sh、na+-k+-atp酶活性的影響本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立糖尿病動(dòng)物模型,觀察模型動(dòng)物血糖升高、神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降,細(xì)胞代謝發(fā)生變化。苦蕎麥黃酮能