高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法聯(lián)用分析和鑒定苦木中苦參堿及氧化苦參堿

苦木原植物系苦木科植物苦木（d.don）。20世紀七八十年代日本學(xué)者和中國學(xué)者對苦木的化學(xué)成分研究較多,證明其主要含有生物堿和苦味素類化合物,其次為三萜、甾醇、皂苷、香豆素、醌類等。生物堿主要為鐵屎米酮類生物堿、β-carboline類生物堿及二聚體生物堿。因苦木與苦參有相似的功效,作者對兩者進行了對比研究,參照2010年版《中國藥典》山豆根項下薄層鑒別(鑒別苦參堿與氧化苦參堿)對苦木進行研究,發(fā)現(xiàn)在與苦參堿與氧化苦參堿對照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的較微弱的橙黃色斑點,表明苦木中可能存在苦參堿及氧化苦參堿。雖然目前對苦木的化學(xué)成分已有一定的研究,但目前尚未見苦木中苦參堿與氧化苦參堿成分的報道。HPLC-Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀因其具有高分辨率功能,并能給出化合物二級結(jié)構(gòu)信息而成為復(fù)雜體系分析化合物結(jié)構(gòu)的良好平臺。高效液相色譜與串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),具有較高的靈敏度及高度的選擇性,適用于微量成分分析。本實驗利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),來分析和鑒定苦木中苦參堿與氧化苦參堿。1近紅外運動譜儀ACQUITYUPLC/XEVOQ-TOFMS(美國Waters公司),ES源。數(shù)據(jù)由MassLynxTMMSInformatics工作站采集和分析。安捷倫1200高效液相色譜儀-安捷倫6410B三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司),ESI源,數(shù)據(jù)由Masshunter工作站采集和分析;Milli-Q超純水處理系統(tǒng)。甲醇、乙腈均為色譜純(美國J.T.BAKER公司),乙酸銨為色譜純(美國Sigma公司),甲酸為色譜純(Fluak),水為高純水,苦參堿對照品(批號110805-200508)、氧化苦參堿對照品(批號110780-200506)及苦木對照藥材由中國樣品生物制品檢定所提供,苦木藥材由某藥材公司提供。2方法2.1電噴霧b為流動相,脫溶劑、管壓,超聲過濾器長ACQUITYUPLCBEHC18柱(2.1mm×50mm,1.7μm);以0.1mol·L-1乙酸銨溶液(甲酸調(diào)節(jié)pH3.0)(A)-甲醇(B)為流動相,梯度洗脫程序(0~4min,10%~30%B;4~7min,30%~10%B,7~12min,10%B);流速0.3mL·min-1;進樣量10μL。電噴霧正離子模式檢測;源溫度120℃;脫溶劑溫度625℃,噴霧氣體流量600L·h-1,錐孔氣流量50L·h-1。ES源電壓3.0kV,取樣錐孔電壓30V,溫度120℃,噴霧器35psi,氣體流速(N2)9L·min-1。四極桿掃描范圍m/z100~1000,碰撞室能量55V。2.2流動相l(xiāng)-13.色譜柱:Mecherey-NagelNucleosil100-5C18AB(4.6mm×250mm,5μm),以甲醇-0.1mol·L-1乙酸銨(甲酸調(diào)節(jié)pH至3.0)(80∶20)為流動相,流速0.3mL·min-1,進樣量10μL,分析時間12min。質(zhì)譜采用ESI正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式檢測ESI源電壓4.0kV,溫度300℃,噴霧器35psi,氣體流速(N2)9L·min-1,檢測離子對及有關(guān)參數(shù)見表1。2.3對照溶液的制備取苦參堿與氧化苦參堿對照品適量,精密稱定,加甲醇分別制成每1mL含苦參堿與氧化苦參堿各0.2μg的對照品溶液。2.4氯甲烷-甲醇-濃氨試液法取供試品粉末約1g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入三氯甲甲醇-濃氨試液(40∶10∶1)混合溶液50mL,密塞,稱定質(zhì)量,放置30min,超聲處理30min,再稱定質(zhì)量,用三氯甲烷-甲醇-濃氨試液(40∶10∶1)混合溶液補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,精密量取續(xù)濾液25mL,40℃減壓回收溶劑至干,殘渣加甲醇適量使溶解,轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。3結(jié)果3.1化合物的鑒定利用飛行時間質(zhì)譜的高分辨率,獲得化合物的精確相對分子質(zhì)量后結(jié)合計算機軟件給出可能的分子式來鑒定化合物,是近些年新興的技術(shù)。利用MassLynx軟件處理,計算機給出保留時間為1.86min的化合物最可能的分子式為[C15H25N2O]+,其理論相對分子質(zhì)量為249.1967,實測值為249.1985,這與苦參堿的分子式一致;保留時間為2.73min的化合物最可能分子式為[C15H25N2O2]+,其理論相對分子質(zhì)量為265.1916,實測值為265.1959,這與氧化苦參堿的分子式一致。供試品溶液中可檢出與苦參堿與氧化苦參堿對照品保留時間、準確質(zhì)量數(shù)及一級質(zhì)譜、二級質(zhì)譜碎片離子完全一致的色譜峰。見圖1。苦參堿與氧化苦參堿的碎片信息與文獻報道的電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析中苦參堿與氧化苦參堿的裂解規(guī)律是一致的,亦佐證了我們的研究結(jié)果。3.2苦木苦參堿與氧化苦參堿的測定3.2.1方法的檢出限將混合標準品溶液適當(dāng)稀釋后制得一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液,進樣分析,以信噪比S/N=3作為檢出限,S/N=10作為量限,苦參堿的定量限為70.42pg,檢出限為21.12pg;氧化苦參堿的定量限為11.66pg,檢出限為3.50pg。3.2.2標準曲線的建立將苦參堿與氧化苦參堿混合對照品溶液適當(dāng)稀釋后制得一系列不同質(zhì)量濃度的對照品溶液,進樣分析,測定各色譜峰峰面積(Y)對對照品濃度(X,mg·L-1)進行回歸,得到的標準曲線。結(jié)果表明,苦參堿在0.07~10ng線性關(guān)系良好,r=0.9993;氧化苦參堿0.02~10ng線性關(guān)系良好,r=0.9996。標準曲線方程為:苦參堿Y=3.19×10-5X-0.1274氧化苦參堿Y=5.92×10-5X+0.09663.2.3方法的精密度試驗將混合對照品溶液(苦參堿與氧化苦參堿質(zhì)量濃度均為0.2mg·L-1)連續(xù)進樣6次,計算各色譜峰峰面積值的相對標準偏差,結(jié)果精密度良好,苦參堿和氧化苦參堿的RSD分別為1.03%,1.74%,表明精密度良好。3.2.4樣品測定4苦木堿與苦參堿的氧化本文利用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),通過與對照品保留時間、準確分子量及其一級、二級質(zhì)譜比對,證實了苦木中存在苦參堿與氧化苦參堿。考慮到高效液相色譜法-三重四級桿聯(lián)用在定量方面的優(yōu)越性,故采用HPLC-Q-Q-Q對苦木中苦參堿與氧化苦參堿進行進一步定量分析。同時也佐證了苦木中苦參堿與氧化苦參堿的存在。結(jié)果表明,除越南(葉子)未檢出苦參堿、對照藥材(葉子)未檢出苦參堿及氧化苦參堿外,其他各批次樣品中均有不同含量的苦參堿及氧化苦參堿成分檢出,但一般處于較微量水平。檢測的樣品為目前市場流通使用的苦木藥材,其藥用部位不同,產(chǎn)地不同,苦參堿及氧化苦參堿的含量也各異。在枝及心材類的苦木樣品中,均可檢出苦參堿及氧化苦參堿。而兩批葉子類的苦木樣品則只有一批檢出微量氧化苦參堿,其他成分含量則在檢出限以下。苦參堿類生物堿是以苦參堿為代表的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似