乳酸菌黏附上皮細胞作用機制的研究進展

現在，由于大量使用和濫用抗生素，動物腸道菌群嚴重失衡，出現了大量幾種抗藥菌，動物體對各種疾病的抵抗力降低，混合疾病增多，治療難度增加。同時,因抗生素的大量應用,造成畜產品的殘留增加、環境的污染。因而,抗生素等藥物的大量應用造成的弊端已成為畜牧業可持續發展的一個嚴峻的問題。雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生素菌株的分離成功,使我們對于抗生素問題的解決充滿了希望,大量的試驗結果表明,雙歧桿菌、乳酸菌對動物體具有免疫增強、營養、抗御病原體的侵害等作用。這些有益菌的主要作用原理一是通過粘附抗性、競爭排斥和免疫調節功能,限制有害菌體在體內定植;二是通過分泌一些細菌素、氨基酸、維生素、酶類等產物幫助宿主消化和抑制有害菌生長。目前,有關正常菌群在腸道的種類、數量及應用效果的研究較多,而對于有益菌群與腸道粘膜的粘附和定植的機制和影響因素研究較少。本文對目前國內外有關消化道乳酸菌的粘附機制及其影響因素方面的研究情況進行綜述,以期對乳酸菌等有益菌的合理開發利用提供新的思路和理論依據。1共同語言理論1.1乳酸菌的粘連特性過去許多學者認為,益生乳酸菌的粘附具有宿主特異性,而宿主特異性被認為是益生菌的特有性質,因而被作為選擇益生素的標準之一。而又有報道,乳酸菌的粘附特性,并不具有宿主特異性,而是其自身的菌系特異性(RinkinenmM,2003;GusilsC,2002),乳酸菌的粘附特性主要是乳酸菌菌株的獨自特性,粘附性好的菌株對許多宿主來說都具有很好的粘附作用。宿主特異性學說認為,宿主腸道上皮細胞上可能具有某種不同物質與乳酸菌的粘附有關,粘附物質多少與粘附程度有關。而非特異性學說認為在動物生產中選擇益生乳酸菌菌株時首先要考慮高粘附性問題,不同菌株表面物質不同,因而與腸道上皮細胞粘附程度不同。李平蘭等(2002)研究表明,來自豬和人類糞便的不同種類乳酸菌在體外與人結腸癌細胞系HT-29細胞的粘附能力不同,其中雙歧桿菌的粘附能力最高,平均在10.5個菌/細胞;乳桿菌的粘附能力較低,平均在3.2個菌/細胞;球菌的粘附能力很低,平均在2.3個菌/細胞,其中雙歧桿菌中的Bifidobacterium.bifidumO2菌株粘附能力最好,達到18.4±2.7個菌/細胞。乳桿菌中Lactobacillusacidophilus99101菌株粘附能力最好,達到10.2±1.8個菌/細胞,同時,同種不同株的乳酸菌粘附能力有差異,而同屬中來自人糞便和來自豬糞便的乳酸菌的粘附能力沒有明顯差異。今后的研究工作應該從兩方面著手,一是研究消化道不同部位的不同的粘附物質;二是篩選與腸道粘附因子相結合的特異的高粘附性的乳酸菌菌種。1.2宿主表面可能是受體隨著研究的不斷深入,科學家從分子水平角度逐漸發現,粘附作用主要是乳酸菌體表面一些特定的分子如LTA(脂磷壁酸)、PSC(多糖)和粘附素蛋白等識別宿主表面特異的受體的結果。而宿主表面的蛋白、糖蛋白和糖脂有可能就是受體,可有選擇性地吸附特定種類的細菌,沒有被吸附的菌體被流體帶到不利于其生長的環境中去。乳酸菌通過粘附素與腸粘膜細胞緊密結合,在腸粘膜表面定植占位,是形成生理屏障的主要組成部分,如果這個屏障遭到抗生素或其它因素的破壞,宿主便失去了對外來菌的抵抗力,就不能抵御外來菌的入侵或者會使具有耐性的腸內菌異常增殖而取代優勢菌的位置,造成腸道內微生態平衡的失調。1.2.1組織形態功能腸道粘膜上皮細胞,包括粘膜上皮細胞、杯狀細胞(可形成三葉狀蛋白,通過聚合粘性糖蛋白來保護上皮細胞免受外部損害,從而加強宿主防御)、潘氏細胞、未分化細胞和內分泌細胞,還有特異性的上皮細胞,如濾泡相關上皮細胞、膜上皮細胞、腸粘膜上皮細胞數量居多,核呈卵圓形,頂部有大量線粒體,胞質內有豐富溶酶體、微管、微泡系統發達,細胞紋狀緣由致密微絨毛、腸上皮細胞間以緊密連接為主,刷狀緣表面分布致密的糖萼(糖衣)和堿性磷酸酶,它們與分泌型SIgA、杯狀上皮細胞分泌的粘液組成機體與外界的一層屏障,阻止絕大部分外來食物致病原的侵入。SannaEdelman等(2002)通過體外研究乳酸桿菌系對雞消化系統細胞和組織類型以及回腸粘液的粘附作用結果表明,乳酸桿菌粘附至嗉囊的上皮細胞上去,粘附到上皮的小囊濾泡以及成熟的腸道細胞的長柔毛頂端,而未粘附到未分化腸細胞表面如生產粘膜的杯狀細胞或者回腸粘液表面。BernetMF等(1994)用嗜酸乳桿菌(Lbacidophilus)LA1株與腸致病菌一起同人結腸癌細胞系CaCo-2(相當于腸上皮細胞)共同培養,發現腸致病菌的粘附能力受抑制,這可能是乳桿菌細胞與致病菌細胞之間存在的非特異性的對腸上皮細胞頂端受體的空間位阻現象引起的。MackDR(1999)研究提出乳酸菌可以通過改變腸道粘液成分抑制致病菌的粘附,腸道上皮組織細胞分泌的粘液覆蓋于腸道表面,其重要成分就是大分子的粘蛋白(含有長碳水化合物鏈,通過O-糖苷鍵連接N-乙酰半乳糖胺和肽骨架上的蘇氨酸或絲氨酸),粘蛋白Muc2和Muc3是回結腸粘液中的優勢蛋白。他們在體外實驗中發現植物乳桿菌299V和鼠李糖乳桿菌GG能有效地抑制病原性大腸桿菌與腸上皮細胞系HT-29的粘附,但不能抑制其與腸上皮細胞系HeP-2的粘附作用;而在HeP-2細胞系中加入富含粘蛋白Muc2和Muc3的培養基,這兩種菌株就能夠抑制腸致病菌與HeP-2細胞的粘附,當用植物乳桿菌299V與HT-29細胞系,共培養發現粘蛋白Muc2和Muc3的mRNA表達水平提高。表明了這兩株菌對病原菌的粘附抗性是通過提高腸道粘蛋白Muc2、Muc3表達來實現的。雙岐桿菌粘附與腸道粘膜糖蛋白有關。鄧一平等(2000)用豬胃粘膜糖蛋白與雙岐桿菌及表面分子作用表明,雙岐桿菌在體內定植和粘附與其表面分子LTA(脂磷壁酸)、WPG(完整肽聚糖)、PS(多糖)有關。起主要作用的為LTA與WPG,它們與胃粘膜糖蛋白粘附性強。FountainLF等(1994)用ELISA方法檢測了分叉雙岐桿菌對大鼠腸粘膜提取的粘附素在體外的粘附作用,效果較好。雙歧桿菌的黏附素是一種不耐熱的蛋白質,腸上皮細胞上黏附素受體為糖蛋白,與甘露糖有關(鄭躍杰,1997和1999)。由于腸管各區段的粘蛋白成分不同,因此不同腸段粘附的有益菌群的種類和數量不同,這些機理有可能解釋為什么不同種動物不同消化道區段粘附和定植的菌株的種類和數量不同。1.2.2雙歧桿菌通過蛋白凝膠特性檢測細菌組織中的黏附性有關研究者對粘附的分子機制感興趣,開始對與粘附相關的因子進行研究。、BernetMarie-Francoise等(1993).以CaCo-2細胞(具有小腸微絨毛細胞的某些特性)作為粘附細胞研究雙岐桿菌與CaCo-2細胞的粘附機制,電鏡觀察到粘附發生在CaCo-2細胞的頂端刷狀邊緣,細菌與頂端微絨毛相互作用,而自身沒有被損害,在不依賴Ca2+條件下,整個細菌細胞和培養上清液中的蛋白質類的粘附促進物質,能夠促使雙岐桿菌粘附到CaCo-2細胞上,而這種蛋白質類的粘附促進物質具有種屬特異性。用激光共距式細胞儀研究異硫氰酸熒光素(FITC)標記的雙歧桿菌1027株對體外培養的腸上皮細胞的黏附表明,雙歧桿菌的黏附素是一種不耐熱的蛋白質,由細菌分泌至培養液上清中并且從雙歧桿菌1027株上清液中純化出一種相對分子質量為16,000的蛋白質;光鏡及透射電鏡觀察,雙歧桿菌特異性地黏附于LOVO細胞的刷狀緣,被黏附的LOVO細胞表面結構無破壞(鄭躍杰,1997和1999)。GreeneJeffreyd等(1994)研究表明,乳酸菌株LacidophilusBG2FO4和NCFM/N2的粘附作用能夠被蛋白酶所降低,而乳酸菌株LgasseriADH經蛋白酶處理其粘附能力或者沒有被影響,或者被提高,乳酸桿菌物種對人類腸道細胞的粘附機制與細胞表面不同的碳水化合物或蛋白因素都有關系,其中乳酸菌株BG2FO4分泌的橋蛋白可能是首要介導的粘附物質。GusilsC等(1999)用雞的乳酸菌分離的類似凝集素的蛋白碎片來研究探討其粘附腸道上皮的機制,發現有些種類乳酸桿菌能夠凝集甲戊二醛和甘氨酸處理的酵母細胞,而用0.2m甘露糖處理時卻抑制這種凝集反應。有些菌株能夠凝集雞紅細胞,不凝集人的紅細胞,而對其它動物的紅細胞的凝集能力不同。利用電泳技術分析這種凝集素分子量約為50～67kDa。若用脂酶處理,在pH6～7、Ca2+濃度為2mM、Mg2+2mM和37～42℃條件下,能非特異性地增加酵母菌凝集和血凝試驗。Dunne等(1999)用蛋白酶處理了唾液乳桿菌ucc118株后,SDS檢測發現細胞壁表面蛋白中兩個分子(195kD和83kD)被降解,Western-blotting測定證實,195kD蛋白與粘附性相關,因此細菌與腸上皮的細胞的粘附可能通過表面蛋白的配體受體識別結合。在雞的三個種屬乳酸桿菌中檢測粘附決定因素時認為,細菌的粘附主要受靜電作用、疏水空間力、脂磷壁酸和特殊的結構(外在的凝集素和胞外多聚體)的影響,乳酸桿菌株(L.fermentum和L.fermentum.ssp.cellobiosus)細胞表面具有類似凝集素的蛋白質結構,而乳酸菌株fermentumsspcellobiosus表面具有高度疏水作用,而只有動物乳酸菌表面具有核糖醇,磷壁酸(GusilsC等,2002)。Nousiainenandsetala(1998)研究結果也表明,乳酸桿菌利用胞外物質如多糖、蛋白質、脂類和脂磷壁酸可粘附到腸壁上。不同菌株的細胞壁中多糖濃度不同,菌株L.fermentum.ssp.cellobiosus細胞壁中多糖濃度最高,而從乳酸桿菌中提取的凝集素不具有糖殘基,表明不同菌系表面結構中都具有類似蛋白質的物質存在。乳酸桿菌具有不同的表面分子,這些表面分子能夠使乳酸桿菌和腸道上皮細胞作用。2影響微生物復制和繁殖的因素2.1酸性ph環境對乳酸桿菌溶液溶液溶液流變性的影響GreeneJeffreyd等(1994)研究指出在菌株培養上清液中的小分子量熱穩定性的非蛋白因子——酸性pH環境對乳酸桿菌粘附人CaCo-2細胞的效果有影響,能夠改變CaCo-2細胞本身,使乳酸桿菌對其粘附性增強。2.2鈣獨立系統Kleeman和Klaenhammer(1982)研究發現腸道乳酸菌的粘附有兩種不同的機理,一種是需要鈣的非特異性系統,另一種是鈣獨立系統。鈣獨立系統中有兩種乳酸菌成分參與了乳酸菌的粘附,一種成分是抗蛋白酶(與菌體表面有關),另一種是熱穩定的胞外蛋白,該蛋白對蛋白酶敏感。葉桂安等(1997)在比較雙歧桿菌和致病菌對體外腸上皮細胞LOVO細胞株黏附的鈣信號傳遞差異研究中發現,雙歧桿菌黏附能引起LOVO細胞內鈣離子隨時間延長而梯度升高,這主要是源于細胞外Ca2+內流,可能是其作為生理性細菌與腸上皮細胞和諧共生的信號傳遞基礎。2.3對腸道黏膜的黏附菌株倫永志等(2000和2003)觀察滅活的青春雙歧桿菌DM8504菌株對人大腸癌細胞系CCL-229的黏附時發現,滅活的雙歧桿菌可能具有與活菌相同的生態效應;并且滅活的該菌株對腸致病性大腸艾希菌(EP