實時定量r-pcr方法分析小鼠胸腺功能和狀態

胸腺是母乳喂養的中間免疫器官。這是t細胞的區分、發育、選擇和成熟的重要場所。它的免疫功能在抗衰老、抗感染、腫瘤和自身免疫性疾病中發揮著重要作用。胸腺功能和狀態的分析和研究一方面可以直接反映機體免疫狀態;另一方面,HIV病毒感染、腫瘤化療和造血干細胞移植等許多疾病導致的免疫缺陷都與胸腺功能障礙有關,因而有關胸腺功能與狀態分析及其檢測方法的研究成了近年研究的熱點。胸腺的功能和狀態主要由胸腺微環境執行和體現。本研究建立了實時定量RT-PCR的分析方法,對于小鼠胸腺微環境內的相關基因的表達進行準確的定性和定量,分析胸腺微環境及其中細胞的狀態,直接有效地評價胸腺功能和狀態。1材料和方法1.1材料表面1.1.1pcr擴增檢測Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司),Oligo(dT)15Primer(美國promega公司),M-MLVReverseTranscripIptase(美國promega公司),GeneTAQThermalStableDNAPolymerase(英國基因有限公司),SYBRPremixExTaqTM(日本Takara公司),100bpLadder(日本Takara公司),ABIPrism7300sequencedetector(美國ABI公司),LKBBiochorm4060紫外分光光度計(瑞典Pharmacia公司),96孔PCR板(forABI,美國Axygen公司)。1.1.2小鼠、大鼠、國家動物中心1周5只,體質量10g;36周5只,體質量30g,均為SPF級BALB/c小鼠,雌雄兼有,購自南方醫科大學實驗動物中心,合格證號:0002959。1.2方法1.2.1鼠胸徑、細胞培養分別處死1周和36周小鼠,無菌取小鼠胸腺,200目篩網碾磨,收集細胞懸液,胸腺細胞1000r/min離心10min,洗滌2次,計數。1.2.2細胞rna的提取按照TRIzol試劑盒說明書抽提106～107細胞RNA,抽提的RNA用DEPC處理水溶解,0.8%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測抽提的RNA,-70℃長期保存。1.2.3但是，分段的rt-pcr擴增1pcr擴增片段的分析根據GenBankmRNA序列:BC023196.1、NM008505.3、NM008238.1、NM008371.2分別設計引物。GAPDH的上下引物分別為:5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3′,5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3′,擴增的片段大小為200bp;LMO2的上下引物分別為:5′-CTGAGGAACCCGTGGATGAG-3′,5′-CGACACCCACAGAGGTCACA-3′,擴增的片段大小為150bp;Foxn1的上下引物分別為:5′-GACCTTGGGACTGACCTGGAT-3′,5′-TGCCTGTTTCTGCCAGACAA-3′,擴增的片段大小為204bp;IL-7的上下引物分別為:5′-TCTGCTGCCTGTCACATCATC-3′,5′-GGACATTGAATTCTTCACTGATATTCA-3′,擴增的片段大小為250bp。引物由上海博亞公司合成,滅菌的去離子水稀釋引物濃度為10μmol/L。2pcr反應條件的確定本研究采用兩步法進行反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)。其中PCR的反應程序為95℃預變性3min1次,94℃變性35s,60℃退火1min,35個循環。鑒定產物后,摸索PCR反應最適當的擴增條件,包括最適合的模板濃度、引物濃度200～500nmol/L、dNTP濃度50～400μmol/L、鎂離子濃度1.5～5mmol/L及退火溫度55～65℃。從而減少非特異性條帶和引物二聚體的產生,減少測量誤差。1.2.4檢測pcr擴增結果本實驗實時定量PCR反應在ABIPrism7300sequencedetector中進行,使用實時定量PCR試劑盒(SYBRPremixExTaqTM)。根據試劑盒說明書以及上一步普通RT-PCR的優化結果,在96孔PCR反應板中配置反應體系。反應條件為95℃10s預變性一次,95℃30s,60℃15s,40個循環。在同一批反應中,設置樣品Foxn1片段PCR組,樣品LMO2片段PCR組,樣品IL-7片段PCR組,樣品GAPDH片段PCR組,陰性對照組,各組都設2個平行重復。實時定量PCR反應結束后,ABIPrism7300SDS1.3軟件保存結果并分析。根據PCR獲得的熔解曲線和擴增曲線分析結果的可靠性并設定閾值,輸出Ct值。采用比較Ct值定量方法進行基因表達的比值計算。具體的公式為:2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。2結果2.1od20/400比值小鼠胸腺細胞RNA獲得后,紫外分光光度計檢測OD260/280比值在1.7～2.0內。電泳結果也證實RNA質量較好并沒有基因組DNA和蛋白質的污染。2.2反應體系的確定cDNA中GAPDH、LMO2、Foxn1、IL-7基因表達分別擴增后,電泳檢測可觀察到特異性電泳條帶,與預測的目的基因片段大小相同,并在進行第2次PCR后證實確為目標產物(圖1)。確定的反應體系是25μL,上下游引物各200nmol/L,MgCl23.5mmol/L,dNTP250μmol/L,模板cDNA4μL。條件優化后結果顯示,PCR條帶特異性強,無明顯非特異性條帶。2.3基因組化法檢測產物的敏感性和準確性實時定量RT-PCR擴增結果顯示,獲得的反映核酸擴增過程的擴增曲線為S形動力學曲線,不同基因的熔解曲線均為產物單一峰,證實了產物的特異性和準確性(圖2)。確定實時定量RT-PCR反應體系是25μL,上下游引物各200nmol/L,模板cDNA2μL。2.43表達變化比值36周小鼠相對于1周小鼠的胸腺相關基因表達變化比值為:LMO22.54±0.08、Foxn10.68±0.02、IL-70.15±0.03。3實時定量rt-pcr檢測細胞發育機體T淋巴細胞在胸腺內發育、分化、成熟、輸出的過程以及各種胸腺激素的分泌等功能主要是由胸腺微環境執行和體現的。胸腺微環境是一個高度異質性的三維網絡,由胸腺上皮細胞、胸腺細胞以及細胞外基質等共同構成。T細胞在胸腺內的發育是一個比較復雜的過程。在特定階段表達的轉錄調控子可以調節T細胞發育的過程,其中:LMO2是一類負調節因子,調控T細胞的雙陰性(DN)至雙陽性(DP)發育過程調節蛋白E2A。LMO2在DN1和DN2期特定表達,而在正常的DN到DP發育過程中必須是非激活狀態,否則影響細胞的發育。Foxn1(whnthenudegene)轉錄因子是胸腺上皮細胞(TEC)所表達的,并且為胸腺的器官發生過程中的TEC的增殖和分化所必須。Foxn1基因的缺失在人和小鼠中都導致了嚴重的胸腺缺失和免疫缺陷。IL-7(Interleukin-7)是分子量為25kU的糖蛋白。近年來的體內體外實驗已經證明IL-7不僅是早期B細胞的生長因子,也是胸腺早期T細胞的維持生長因子。因此,作者選擇以上幾個胸腺微環境的相關基因的表達進行分析,從而有效地評價小鼠胸腺的功能和狀態。另外,GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)是逆轉錄PCR中常用的內參,它是一類管家基因(housekeepinggene),在真核細胞的基因組里多拷貝恒定表達。作為內參,它和目標基因同批擴增,用來校正樣品之間由于RNA濃度的不同而產生的誤差。本研究通過利用實時定量RT-PCR技術對于1周和36周小鼠的胸腺功能和狀態進行了比較研究,結果發現,36周小鼠的Foxn1、IL-7基因的表達下降,而LMO2基因的表達量上升。胸腺的多種分泌因子(Foxn1、IL-7)表達活性下降表明,36周小鼠胸腺微環境中的胸腺上皮細胞活性和功能下降,胸腺微環境受到