小麥禾谷孢囊線蟲病生防菌株分離及盆栽防治效果

小麥草仁菌?。╟cn）是一種全球土壤疾病，可危害小麥、大麥、麥冬、黑麥等谷物和飼料。自1989年在湖北首次報道以來,該病害已廣泛分布于我國湖北、河南、河北、山東、山西、陜西、甘肅、內蒙、青海、安徽、北京等10多個省市自治區,以黃淮麥區發病最重。2007—2008年在我國小麥主產區河南省進行小麥禾谷孢囊線蟲病普查,發現鄭州、安陽、許昌等15個地市均有不同程度發生,發病面積達120萬hm2,其中重病田面積在10萬hm2以上。王振躍等報道,該病一般減產20%~30%,有些地塊甚至高達50%以上,并有不斷蔓延之勢。針對小麥孢囊線蟲的防治方法國內外已做了一些研究,并摸索出了一些有效的防控措施。澳大利亞通過培育和種植抗病小麥品種,已經有效地控制了孢囊線蟲病的危害;Brown研究表明,輪作和適當調整播期可有效控制該病害。吳緒金等研究發現,涕滅威、滅線磷等殺線劑具有一定的防治效果。但是,國內大面積種植的小麥品種多數表現感病,輪作等農業措施在我國廣大麥區難以實施,且化學殺線劑毒性大、成本較高,因此,尚缺乏有效的防治手段。國內外已有許多植物線蟲病害生物防治方面的研究,并篩選出大量的生防微生物,如細菌、真菌(捕食性真菌、線蟲內寄生真菌、卵寄生真菌、產毒真菌、菌根真菌等)、放線菌、原生動物、捕食性線蟲、殺線植物等,有些生防微生物如淡紫擬青霉Paecilomyceslilacinus、厚垣輪枝孢菌Verticilliumchlamydosporium已經開發出相應產品并在生產上推廣使用,但有關小麥禾谷孢囊線蟲病生物防治則鮮有報道,為此,本試驗對小麥禾谷孢囊線蟲生防真菌進行了篩選和鑒定。1材料和方法1.1孢囊分離方法病田土樣采自河南省鄭州市郊區、滎陽市、安陽縣、許昌縣等地小麥孢囊線蟲病發生比較嚴重的地塊,采用土鉆多點取樣。取土時將表層干土去除,取0~20cm層的土壤,將土樣裝入封口塑料袋,帶回實驗室備用。將取來的樣品在室內風干2~3周,先用直徑3mm的篩子除去較大土塊和殘根,然后采用Fenwick-Oostenbrink改良漂浮法分離孢囊。預先將漂浮器和篩子淋濕,漂浮筒內灌滿清水,將風干土樣放入頂篩中,用水流沖洗,使土壤全部淋洗到漂浮筒內,并從環頸水槽流到60目篩子中。挑取篩子上的孢囊放入培養皿中備用。1.2菌落篩選、培養將孢囊用無菌水沖洗3次,放在潔凈培養皿里。在體視鏡下將孢囊刺破,然后移入馬丁氏培養基平板上25℃培養,發現孢囊上長出菌落后,挑取少許菌落邊緣的菌絲移入PDA平板上培養。采用單孢分離法進行純化,并將純化的真菌菌株移入PDA斜面并編號,在25℃恒溫培養箱培養7天后移到4℃冰箱中保存。1.3小麥孢囊線蟲孵化和接種生防菌擴繁:將分離到的真菌菌株接種到經過高溫滅菌處理的麥粒砂培養基中,在25℃條件下培養15天備用。小麥播種及生防菌接種:供試小麥品種為感病品種溫麥19,種子由河南省農業科學研究院小麥研究所提供。從沒有發生過小麥禾谷孢囊線蟲病的砂壤土田塊中采集土壤,過篩后160℃烘箱處理2h。每缽(約300g)加入5g培養好的生防真菌麥粒砂培養物,將培養物與經過滅菌處理的無病土混合均勻,裝入培養缽并輕輕壓實,并設不接種處理作為對照。每處理6次重復。將催芽的小麥種子放入上述培養缽中,每缽種5粒種子,然后覆蓋1~2cm過篩滅菌土,放入鋁托盤中,盤中澆透水后放在15~20℃人工氣候室內培養。線蟲孵化和接種:先用低溫刺激法孵化小麥孢囊線蟲2齡幼蟲(J2)。方法:①將收集的孢囊放于離心管中,在4℃的冰箱中低溫處理30天,再放于15℃恒溫培養箱中培養30天以孵化幼蟲;②用組織破碎器芯在離心管中輕輕扭動1~2次后加入5~10mL無菌水,用三角瓶收集破碎孢囊及J2幼蟲懸浮液;③將懸浮液倒入200目篩子中,用無菌水輕輕洗下200目篩子上的J2幼蟲,用三角瓶收集J2幼蟲;④定容至50mL,搖勻后取1mL滴入計數皿,在解剖鏡下計數,確定線蟲濃度。出苗7天后開始接種J2線蟲,先用玻璃棒在營養缽中小麥幼苗根部附近插入3~6cm深小洞,同時將已制備好的J2幼蟲懸浮液200條/株用移液槍注入小洞內,再用細土封口。每隔3天接種1次,共接種3次,每株共接種600條幼蟲。病情調查:接種60天后,調查小麥根部根結形成情況。將植株連根挖出,并盡可能保持根系完整。將取出的植株根系用自來水沖洗干凈,放在盛有清水的塑料盤中進行病情調查,計算防治效果。病情分級標準:0級:根部無根結;1級:每株根部有1~5個根結;2級:每株根部有6~10個根結;3級:大部分根上有根結,單株10個根結以上;4級:根結相連成須根團,難以計數。1.4田間取樣方法根據室內試驗結果,選取F37、F15、F33等11個對小麥禾谷孢囊線蟲初篩防控效果較好的菌株,在許昌縣小麥孢囊線蟲病發生嚴重地塊進行大田防治效果測定。供試生防菌株采用麥粒砂培養基擴繁后以每米行長施入5g的劑量進行溝施,即取適量細干土與揉碎的生防菌培養物混合,撒施于播種溝內,與周圍土壤混勻后再進行播種。另設不處理的小區作為空白對照。分別在苗期和灌漿期調查小麥根部根結和孢囊形成情況,計算病情指數和防治效果。田間取樣方法采取隨機3點取樣,每樣點取20株,用小鐵鏟連同植株根系土壤挖出,帶回室內調查。苗期調查分級標準及計算方法同1.3。小麥灌漿期病情分級標準及計算方法參照吳緒金等。即0級:根部無孢囊,無病;1級:感染極輕微,1~5個孢囊/株;2級:輕度發生,6~20個孢囊/株;3級:中度發生,20~40個孢囊/株;4級:嚴重發生,單株孢囊在40個以上。病情指數=[(∑各級發病株數×各級代表值)/(調查總株數×最高級別代表值)]×100;防治效果(%)=[(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數]×100。不同分離菌株的防治效果采用SPSS13.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗。1.5生殖器菌的形態和鑒定1.5.1形態特征觀察分別挑取待測真菌菌絲于PDA培養基上,在25℃條件下培養7天后,肉眼觀察菌株生長速度、菌落顏色及表面特征等,測量菌落大小,用番紅染色后在顯微鏡下進行菌絲、孢子形態觀察,記載菌株的形態特征。參照魏景超、Booth、孔華忠等進行形態學鑒定。1.5.2dna的pcr擴增分別稱取50~100mg待鑒定菌株的菌絲體,加液氮充分研磨后,迅速轉移至1.5mL離心管中,用上海生工生物工程技術服務有限公司的通用DNA純化試劑盒提取菌株基因組DNA,并利用該公司合成的通用引物ITS1:5′TCCGTAGGTGAACCTGCGG3′和ITS4:5′TCCTCCGCTTATTGATATGC3′進行PCR擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠回收純化后,將DNA片段連接到pMD19,然后將連接產物轉化到感受態細胞中,進行陽性克隆的篩選。將白色克隆挑入LB培養液中,菌液送上海英駿生物技術有限公司測序,采用DNAman軟件進行序列分析,并在NCBI數據庫上通過BLAST比對分析。2結果與分析2.1對小麥禾谷孢囊線蟲病的防治效果結果表明,42個菌株中以F37和F15防治效果最好,均為64.7%,F33、F04、F26、F08、F03、F13、F11、F20和F25等9個菌株對小麥禾谷孢囊線蟲病的防治效果均達到50%以上,顯示出較好的生防潛力;F19、F22、F16和F41等4個菌株達到45%以上。以上15個菌株處理后病情指數均顯著低于對照。F24、F28等18個菌株雖然也有一定的防治效果,但病情指數與對照差異不顯著。而F12、F35等8個菌株處理后病情指數甚至高于對照,說明無防治效果(表1)。2.2對病害的防治效果結果顯示,各菌株大田苗期防治效果普遍較低,11個供試菌株雖病情指數均顯著低于對照,但對病害的防治效果均低于40%,且各菌株之間差別不大。灌漿期調查發現,F26、F04、F20和F08等4個菌株田間防治效果大于40%,F37菌株防治效果也在35%以上,這5個菌株處理病情指數均與對照差異顯著,而其它供試菌株防治效果均低于30%(表2)。2.3生殖器菌的鑒定2.3.1菌株鑒定及初步鑒定F20菌株:在PDA培養基上25℃培養7天后,菌落直徑為35~60mm,暗綠色或灰綠色,質地絨狀;分生孢子大量產生,易分散;菌絲體白色或近于白色;分生孢子橢圓形或長橢圓形,壁光滑;分生孢子梗帚狀,帚狀枝通常雙輪生,偶有三輪生或單輪生,梗基每輪2~3個,彼此通常較緊貼;瓶頸每輪5~8個或更多(圖1)。初步鑒定為半知菌青霉屬的草酸青霉Penicilliumoxalicum。F37菌株:在PDA培養基上25℃培養7天,菌落直徑為70mm,菌落正面紫紅色,氣生菌絲較發達,呈密絨狀或絮狀,產生紫紅或紫黑色色素,隨菌齡的增加而變深;小型分生孢子鏈狀著生在分枝的分生孢子梗上,卵圓形、橢圓形或腎形,單細胞,大型分生孢子少見,未見厚垣孢子(圖2)。初步鑒定為半知菌類鐮刀菌屬Fusarium的一種真菌。F04菌株:在PDA培養基上25℃培養7天后,菌落直徑70mm,菌落正面白色,生長均勻,背面初期白色,后期變淺黃色;菌絲致密平鋪,成地毯狀。長時間生長后基質產生淡黃色斑塊。由于不產孢,無法進行形態學鑒定。F08菌株:在PDA培養基上25℃培養7天,菌落直徑80mm,菌落白色,卷毛狀,邊緣平鋪,均勻生長,背面白色至淡黃色;分生孢子梗粗短,無色,光滑;產孢細胞瓶梗狀,無色,光滑;大型分生孢子呈鐮刀形或紡綞形,無色,光滑,兩頭漸細,有的頂端喙狀,足細胞明顯,1~4隔;小型分生孢子數量少,呈圓形或腎形,大多數單細胞,少數1個分隔,無色;厚垣孢子形成于菌絲及分生孢子中,球形,單生或成串(圖3)。初步鑒定為半知菌鐮刀菌屬的茄病鐮刀菌Fusariumsolani。F26菌株:在PDA培養基上25℃條件下培養7天后呈淡褐色或褐色,絨毛狀,菌落直徑50~70mm,背面黑褐色,菌絲體大量表生,少數埋生,菌絲淡褐色至中褐色,光滑,有分隔,單生或有分枝;分生孢子梗直立或略彎曲,側生于菌絲上或直接著生于菌絲頂端,產孢處形成膨大的囊狀體,分生孢子單生,長方形或寬橢圓形,淡褐色至中褐色,具1~3個橫隔膜,1~4個縱隔膜,大部分縱隔膜連續貫穿于橫隔膜之間,在橫隔膜處有輕微的縊縮現象(圖4)。初步鑒定為半知菌匍柄霉屬Stemphylium的一種真菌。2.3.2-內酰胺酶菌株的篩選和序列分析分別測定了F04、F08、F20、F26和F37等5個菌株的ITS序列,并登錄GenBank,登錄號分別為GU055594.1、EU733633.1、FJ977097.1、EU807938.1和EF589878.1。經與NCBI數據庫進行BLAST比對分析,5個菌株相似性最高的屬種分別為毛殼菌Chaetomiumsp.、茄病鐮刀菌F.solani、草酸青霉P.oxalicum、茄匍柄霉Stemphyliumsolani和層出鐮刀菌Fusariumproliferatum,序列相似度分別達到99.61%、99.82%、99.83%、100.00%和99.47%。除了F04菌株因人工培養難以產孢無法進行形態鑒定并與分子生物學鑒定結果比對外,其它菌株形態學與分子生物學方法鑒定結果均一致。3對當地土壤污染的適應小麥禾谷孢囊線蟲病已經成為我國黃淮麥區重要土傳病害,在目前缺乏有效防治措施的情況下,探索新的防治方法十分必要。本試驗結果表明,多數生防菌株室內防治效果與田間防治效果基本一致,但也有一些菌株室內試驗結果與大田試驗不盡一致,如F15菌株在室內盆栽試驗中防治效果達到60%以上,而在大田試驗中灌漿期防效只有6.47%,這可能與該菌株在自然土壤中定殖能力較差有關。有研究發現,一些生防菌株在無菌土中可以很好地定殖和生長,但在自然土壤中由于多種土壤微生物的相互競爭或對土壤理化環境適應性較差,難以大量定殖。本試驗中F37、F20和F04等菌株的防治效果比較穩定,其作用機制和利用途徑還有待深入研究。匍柄霉屬和毛殼菌屬真菌可防治一些真菌病害,草酸青霉P.oxalicum和茄病鐮刀菌F.solani可寄生于其它植物線蟲,林