乳酸桿菌表型和基因型分析研究進展

乳酸桿菌屬于嗜水性植物，屬于嗜水性植物門。它可以通過發酵葡萄糖（或使用碳酸鹽）產生大量的乳化。這種藥物可用于調節腸道菌群，預防或緩解胃腸道疾病，改善身體免疫功能，減少與酒精中毒癥病有關的內毒素作用，有利于人類健康。近年來廣泛應用于保健品、藥物、果汁、糖果、冰淇淋的研發,某些乳酸桿菌尚被用于疾病的輔助治療。2005年初,乳酸桿菌共有100個種,而到了2007年則多達120個種。鑒于乳酸桿菌種類的多樣性,來源的多渠道,可用于生產食品類別和形式的廣泛性,食用人群的敏感性等,使乳酸桿菌的安全狀況越來越受到公眾的關注。值得指出的是,乳酸桿菌的作用具有株的特異性,即使是傳統認為安全的乳酸桿菌菌種也不能保證種內所有菌株均安全,因此正確對乳酸桿菌分離鑒定是保證其產品食用安全性的重要基礎,本文就乳酸桿菌分離鑒定的最新研究進展進行綜述。1培養基的選擇從不同的基質中分離乳酸桿菌時,根據乳酸桿菌所在生境的不同以及是否為優勢菌可選擇不同組分的培養基。目前比較常用的培養基有MRS(deManRogosaSharpe)培養基、RSMA(RutheniumSkimMilkAgar)培養基、番茄汁瓊脂培養基(TomatoJuiceAgar)等。1.1菌株分離培養基當乳酸桿菌是待分離區系的優勢菌時,常用MRS培養基對其進行分離。一些常見的食品污染菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等在MRS培養基上生長較差或幾乎不生長,從而減少了雜菌的污染,降低了分離難度。目前MRS培養基已經成為國標上公認的用于乳酸桿菌分離較好的培養基。常用于從乳酸桿菌發酵制品中分離菌種以及菌種分離后的傳代培養。1.2基于rsma培養基的乳酸桿菌分離RSMA培養基是近幾年發展起來用于乳酸桿菌分離的一種非選擇性培養基,由于該培養基中加入0.05%的釕紅染料,因此其最大優點是可以使不同菌種在其表面生長并形成顏色各異易于鑒別的菌落。通常情況下,乳酸桿菌在RSMA培養基上形成黃色菌落,而嗜熱鏈球菌為紫紅色菌落,腸球菌是白色菌落。因此,簡單培養后不用通過常規染色和鏡檢就可以將乳酸桿菌與其他細菌鑒別開來。ELLI等應用RSMA培養基成功的從人糞便樣品中分離出了乳酸桿菌。由于此培養基的營養成分比較單一,所以不適于從菌群組成復雜的環境中分離乳酸桿菌。1.3番茄汁對乳酸桿菌生長的影響這是一種傳統的用于分離乳酸桿菌的培養基,此種培養基由于含有一定量的番茄汁,為乳酸桿菌的生長提供必要的營養,使得乳酸桿菌在此環境下更容易生長。但由于配置過程中需要制備新鮮番茄汁,所以操作起來較為費時費力,目前已逐漸被MRS等培養基所代替。1.4osetween培養基某些選擇性培養基可用于從菌群復雜的基質(例如腸道)內進行乳酸桿菌的分離。APT(AllPurposeTween)培養基通常用于從肉制品中分離乳酸桿菌,改良的RogosaSL(RogosaSodiumLactateModified)完全選擇性培養基則常用于胃腸內容物中乳酸桿菌的分離。Briggs瓊脂培養基和SL(SodiumLactate)培養基常用于酸奶中乳酸桿菌的分離。2乳酸桿菌的鑒定2.1革蘭染色、鏡檢乳酸桿菌屬水平的鑒定是乳酸桿菌整體鑒定過程中較為簡單且最為基本的步驟。常用的方法是對分純后的乳酸桿菌培養物進行革蘭染色、鏡檢,選擇無分叉的G+桿菌。如果這些無分叉G+桿菌經過培養后,在pH4.5的條件下能夠生長并且過氧化氫試驗、硝酸鹽還原試驗、聯苯胺反應、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗均為陰性即可鑒定其為乳酸桿菌屬。2.2評估的不同程度2.2.1聚合物發酵碳納米卡,采用api50c-chl鑒定系統指示劑為乳酸桿菌種水平的生化試驗主要采用糖醇類發酵試驗。不同乳酸桿菌對糖的利用情況不一,以此可作為種水平鑒定的依據。傳統的生化鑒定方法是配制各種特異性生化反應管,該方法雖然成本較低,但費時費力,不適于大批量樣品的快速鑒定,并且反應管種類較少所以結果的判定受限制。近年來,法國梅里埃公司研發的API50CHCHL鑒定系統試驗卡是由49種可發酵碳水化合物組成的簡易培養基,接種菌后反應48h即可直讀結果。由于乳酸桿菌發酵碳水化合物產酸導致pH值下降使指示劑變色,所以結果極易判別。API50CHCHL鑒定系統是目前國內外應用最廣泛、結果準確可靠的快速生化鑒定系統。缺點是價格昂貴,不適于大規模菌種的鑒定。2.2.2基因檢測2.2.2.rapd技術測定乳酸桿菌的鑒定RAPD技術是在20世紀80年代末90年代初發展起來的一種新的、能夠全面系統地探索基因組功能的強有力高新技術工具,通過對PCR產物的分析檢測,以獲得基因組DNA在待測區域內的多態性進行鑒別,目前RAPD-PCR技術已成為乳酸桿菌鑒定技術的發展趨勢,2006年RANTSIOU等利用RAPD技術對從發酵肉制品中分離出的三種乳酸桿菌進行了分類,成功的將69株彎曲乳酸桿菌歸為7類,69株植物乳酸桿菌歸為10類,173株清酒乳酸桿菌歸為23類。有報道指出,若將RAPD技術與生化反應結果相結合可更準確地鑒定乳酸桿菌。RAPD具有快速、簡便、成本相對較低、特異性強等特點,尤其對于鑒別親緣關系較近的細菌更為有效,缺點是需要相關的標準菌株做參比。2.2.2.對乳酸桿菌的pcr和rflp擴增RFLP是一種全基因組方法,它作為第一代分子生物學方法在過去的幾年被廣泛應用于微生物的鑒定,目前,也被廣泛應用于乳酸桿菌的分類及鑒定。已發表文獻中包括針對乳酸桿菌內特定基因進行特異擴增的PCR方法,如針對tuf(encodingforelongationfactorTu)基因的PCR方法可以將包括德氏乳酸桿菌德氏亞種、德氏乳酸桿菌保加利亞亞種、德氏乳酸桿菌嗜酸亞種、嗜酸乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌、瑞士乳酸桿菌、發酵乳酸桿菌等15種乳酸桿菌進行鑒別。針對mal(malolacticenzyme)基因的PCR方法可以將包括唾液乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、植物乳酸桿菌、乳酸乳酸桿菌、短乳酸桿菌等9種乳酸桿菌鑒別開來。前不久BLAIOTTA等針對乳酸桿菌的hsp60(heat-shockprotein)基因進行特異性PCR-RFLP擴增,結果對包括干酪乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、植物乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、彎曲乳酸桿菌、瑞士乳酸桿菌、發酵乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌等43種乳酸桿菌進行明確的鑒定。RFLP的主要優點在于操作簡便、快速,終點判斷準確,缺點是酶的選擇困難。通常情況下,這種方法需要兩種或兩種以上的酶相結合方可對諸多菌種進行鑒別,所以在酶的選擇上需要較高的專業知識水平,并且部分酶價格昂貴,因此實驗成本較高。2.2.2.真空包裝牛肉中的dage檢測技術PCR-DGGE最初被用來監測基因突變,后來被廣泛的應用于微生物研究,目前國外已將該技術已廣泛用于食品中乳酸桿菌菌株的篩選、分組、鑒定以及對食品品質評估和質量控制。TABASCO等2007年用PCR-DGGE技術成功的將發酵奶制品中的保加利亞乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、類干酪乳酸桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等進行了鑒別,FONTANA等也用同樣的技術將真空包裝牛肉中的清酒乳酸桿菌、彎曲乳酸桿菌、冷明串珠菌區分出來。由于PCR-DGGE可以區分含堿基成分不同而片段大小一致的DNA序列,甚至一個堿基對的不同都會引起DNA片段停留于凝膠的位置各異,所以與傳統乳酸桿菌的鑒定技術相比,具有快速、全面的特點。同時DGGE技術也有其限制性,主要表現在:①只能分離較小的片段(最長達l000bp),因此提供的信息有限,片段太長時解離率下降。②DGGE在種水平上鑒定細菌菌群結構有限。③依據16SrDNA的DGGE研究菌群多樣性,由于某些種類16SrDNA的拷貝之間的異質性問題及異源核酸雙鏈分子的檢出可能會導致自然菌群中細菌數量的過多估計。2.2.2.多重pcr方法鑒別乳酸桿菌由于乳酸桿菌種類繁多,菌群組成復雜,因此傳統的PCR方法難以達到多種乳酸桿菌快速同時鑒定的目的,這一不足可以通過在單一反應中同時擴增多個位點的多重PCR預以彌補。由于多重PCR同時擴增多個目的基因,具有節省時間、降低成本、提高效率的優點,所以一經提出即得到研究者的青睞,并且發展迅速,現已成為乳酸桿菌分類鑒定的一項成熟而重要的研究手段。已有學者利用這項技術同時將嗜酸乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、德氏乳酸桿菌、瑞士乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、植物乳酸桿菌區分開來。其它一些乳酸桿菌如短乳酸桿菌、發酵乳酸桿菌、希氏乳酸桿菌、食果糖乳酸桿菌等都可以應用多重PCR方法進行一次性鑒別。該技術的難點在于引物的設計和PCR擴增條件的標準化等,此外,對操作者技術要求較高并且多重PCR的結果特異性較差。2.2.2.傳統微生物鑒定方法,主要表現為DNA的(G+C)含量測定、DNADNA同源性測定(即DNADNA雜交)等比較傳統的微生物基因鑒定方法也用于乳酸桿菌的鑒定,但由于其它快速、靈敏、特異方法的發展,目前這兩種方法較少用于乳酸桿菌的鑒定。2.3乳酸桿菌pfge標準分析技術的應用脈沖場凝膠電泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)自1996年美國食源性疾病監測分子分型國家網絡實驗室(theNationalMolecularSubtypingNetworkforForborneDiseaseSurveillanceofUSA)建立了PulseNet以來,先后建立了針對沙門菌(salmonella)屬、志賀菌(shigella)屬、李斯特菌(listeria)屬等多個菌株的PFGE標準方法,為微生物的基因鑒定做出了貢獻,PFGE方法已逐漸成為微生物株水平鑒定的金標準。目前PFGE方法也被認為是乳酸桿菌分類鑒定的最好方法。有研究表明,選用兩種選擇性較好的內切酶就可以完成PFGE對乳酸桿菌的鑒定,還可以為判斷乳酸桿菌基因組大小和基因圖譜的建立提供依據。目前各國學者正致力于乳酸桿菌PFGE標準方法的建立,并且在鼠李糖乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、彎曲乳酸桿菌、植物乳酸桿菌等眾多乳酸桿菌株水平的分型鑒定方面取得了良好的分型效果。乳酸桿菌PFGE鑒定的難點在于內切酶的選擇以及電泳條件的優化,常用的內切酶主要包括ApaI、NotI、SfiI、AscI、I-CeuI和SmaI等。缺點在于PFGE技術費時費力。但相對于其它方法而言,PFGE對乳酸桿菌菌株的鑒別比核糖分型技術、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳等更有為效。3乳酸分型鑒定技術由于乳酸桿菌對人體的作用存在株的差異,同一種內不同株間其功能和特性各異,因此對于乳酸桿菌種株水平鑒定技術的研究