影響山核桃嫁接成活率的生理生化因子研究

山核桃原產(chǎn)于中國，是浙江省的一個(gè)特色干果。現(xiàn)在，由于產(chǎn)量不穩(wěn)定，年產(chǎn)量長，樹枝高，收獲困難，為了促進(jìn)早期結(jié)果，實(shí)現(xiàn)育種和繁殖是良好育種的重要手段。山核桃的移栽和繁殖有許多優(yōu)點(diǎn)。錢耀林等人以化香為砧，成活率低，但這種砧的成活率約為20%。黃建欽等人認(rèn)為，低移植核桃的主要原因是山核桃的薄移植層，移植過程中很難識別砧木的生理生化因素。然而，關(guān)于山核桃移植的影響研究還不夠。為了進(jìn)一步研究山核桃移植的機(jī)制，分析了嫁接植物形成過程中砧穗生理生化因素的變化與移植成活率之間的關(guān)系。1材料和方法1.1生長枝的測定試驗(yàn)于1999年至2001年在浙江林學(xué)院資源與環(huán)境系生物技術(shù)研究所進(jìn)行,山核桃砧木采用1年實(shí)生苗,接穗為結(jié)果樹的生長枝,從取材起測定.之后在嫁接前進(jìn)行測定1次.嫁接以后每隔一定時(shí)間測1次,取樣時(shí)間為上午9:00左右.1.2可溶性蛋白質(zhì)及酶活性的測定含水量測定參照李合生的方法,采用阿貝折射儀測定.單寧參照孫達(dá)旺的方法,采用六氰合鐵酸亞鐵吸光光度法測定.可溶性糖參照薛應(yīng)龍的方法,采用蒽酮比色法測定.可溶性蛋白質(zhì)測定參照Bradford的方法,考馬斯亮蘭G250染色后,595nm測定可溶性蛋白質(zhì)含量.測定酶活性時(shí),稱取1.0g材料放入研缽中,加8.0mL預(yù)冷的提取緩沖液,在0～4℃低溫下研磨,勻漿液經(jīng)15000×g冷凍離心20min,上清液用于多酚氧化酶(PPO)活性的測定,測定參照蔣德安的方法,以每分鐘增加1.0光密度作為1個(gè)酶活單位(U).2結(jié)果與分析2.1穗條嫁接后成活率山核桃嫁接的接穗部位對嫁接成活有極顯著的影響.2001年3月采集的穗條嫁接后成活率最高;穗條不同芽位嫁接后,頂芽成活率為0,1級到7級側(cè)芽成活率先逐漸增加而后又下降(表1).2.2核桃穗條的生理生化因子的變化2.2.1不同采穗時(shí)間對山核桃穗條激發(fā)的影響由表2可知,不同時(shí)間采集的穗條總含水量基本不變,變化范圍均在44%～51%左右,但自由水含量差異顯著.由于3月份進(jìn)入春季,氣溫回暖,山核桃接穗細(xì)胞新陳代謝開始加強(qiáng),需要大量的自由水,因此,3月16日采集的穗條,其不同芽位的自由水含量顯著高于12月8日和2月5日采集的相應(yīng)穗條的自由水含量.自由水是植物體內(nèi)新陳代謝物質(zhì)的運(yùn)輸主體,自由水含量越高,細(xì)胞滲透活動越活躍,越有利于細(xì)胞的分裂、生長和繁殖,促進(jìn)愈傷組織的形成.同一穗條不同芽位由頂芽到第7級側(cè)芽其總含水量逐漸下降,其中12月采集的穗條總含水量下降了13%,而3月采集的穗條只下降了5%,表明3月份采集的穗條總含水量在不同芽位分布較均一,嫁接利用率較高.同一穗條不同芽位由頂芽到第7級側(cè)芽其自由水含量逐漸下降,而后又逐漸升高,不同采穗時(shí)間變化基本一致,山核桃穗條第3級至第5級側(cè)芽自由水含量最低(表2),表明山核桃穗條第3級至第5級側(cè)芽束縛水含量較高,傷流液較少,嫁接時(shí)耐受傷害能力較強(qiáng),嫁接成活率相應(yīng)較高.因此,山核桃嫁接成活與自由水含量密切相關(guān).2.2.2種不同時(shí)間采集的穗條可溶性糖、自頂芽及可溶性糖含量的變化朱玉球等在山核桃莖尖培養(yǎng)中指出,適量的碳源有利于植物愈傷組織的大量產(chǎn)生,中等濃度的蔗糖對山核桃愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖、生長最有利.結(jié)果表明(表2):不同時(shí)間采集的穗條自頂芽由上而下可溶性糖含量逐漸下降,3種不同時(shí)間采集的穗條可溶性糖含量以3月16日最高,主要由于冬季山核桃接穗細(xì)胞內(nèi)含有大量的淀粉質(zhì)體,貯藏了大量的淀粉,隨著時(shí)間推移,春季的到來,穗條新陳代謝的加強(qiáng),大量的淀粉被降解為可溶性糖,供給側(cè)芽的萌動所需.由表3可知,3種不同時(shí)間采集的穗條可溶性蛋白質(zhì)含量相差較大,這與可溶性糖含量變化一致,其中以12月8日可溶性蛋白質(zhì)含量最低,平均為42.30mg·g-1FW,3月16日可溶性蛋白質(zhì)含量最高,平均為75.70mg·g-1FW.不同時(shí)間采集的穗條自頂芽由上而下可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸下降,表明不同時(shí)間采集的穗條及穗條不同芽位新陳代謝活性不一致.2.2.3穗條抗氧化活性的變化山核桃嫁接成活率低,一般認(rèn)為是單寧含量較高,愈傷組織難以形成.由表3可知:3種不同時(shí)間采集的穗條中,以3月16日采集的穗條單寧含量最低.同一穗條中,頂芽單寧含量最高,第1級側(cè)芽至第7級側(cè)芽變化不大.隨著春季溫度上升,芽的萌動,山核桃穗條中單寧含量減少(另文待發(fā)表).接穗中單寧的含量變化范圍為18.30mg·g-1FW～31.50mg·g-1FW,低于柿樹和楊梅,表明單寧不是影響嫁接成活的主要因子.不同時(shí)間采集的穗條以頂芽多酚氧化酶活性最大,平均為68.40U·kg-1,然后下降,至第7級側(cè)芽達(dá)到最低,平均為30.60U·kg-1.從不同采穗時(shí)間來看,3月16日采集的穗條多酚氧化酶活性比其它時(shí)間采集的穗條都強(qiáng),這與蛋白質(zhì)含量變化(表3)一致.多酚氧化酶活性加強(qiáng),植物的自我保護(hù)能力也加強(qiáng),清除酚類物質(zhì)在植物體內(nèi)的毒害,對細(xì)胞活動也越有利.2.3在育種過程中，砧和穗的生理生化因素發(fā)生了變化2.3.1嫁接穗中可溶性蛋白質(zhì)含量變化4月3日嫁接的穗條其含水量在第9天達(dá)到最低,而砧木中含水量隨著春季溫度上升,砧木的萌動緩慢上升,9d之后,穗條和砧木其含水量同步緩慢上升.4月23日嫁接的穗條其含水量在第5天就達(dá)到峰值,比4月3日嫁接的穗條提早4d,表明4月23日嫁接的穗條由于氣溫已經(jīng)上升,新陳代謝旺盛,水分流動性加強(qiáng).砧木含水量隨著時(shí)間推移逐漸下降,至第11天達(dá)到最低,而后又緩慢升高(表4).2種不同時(shí)間嫁接的山核桃,其砧木和接穗中的可溶性蛋白質(zhì)含量,隨著時(shí)間推移,顯現(xiàn)先上升后下降的過程.4月3日嫁接的穗條和砧木其蛋白質(zhì)含量在嫁接后第15天達(dá)到高峰,而4月23日嫁接的穗條和砧木其蛋白質(zhì)含量在嫁接后第5天就達(dá)到峰高,表明氣溫回暖,代謝加強(qiáng),4月23日嫁接的山核桃苗可溶性蛋白質(zhì)含量比4月3日嫁接的苗木提早10d達(dá)到峰值,有利于穗條和砧木接合處的接合(表4).2.3.2穗條和生物酶活性接穗和砧木中的單寧含量隨著嫁接后天數(shù)的延長,呈現(xiàn)上升趨勢,4月23日嫁接的穗條和砧木其單寧含量平均值分別為26.80、19.90mg·g-1FW,高于4月3日嫁接的穗條和砧木(25.30、17.00mg·g-1FW)(表5).4月23日嫁接的穗條和砧木其多酚氧化酶活性(74.00、55.00U·kg-1FW)顯著大于4月3日嫁接的穗條和砧木(35.40、33.60U·kg-1FW),且上升輻度較大,4月23日嫁接的穗條和砧木分別上升2.09、1.91倍,而4月3日嫁接的穗條和砧木分別只有上升1.32、1.75倍.由于多酚氧化酶活性上升的幅度高于單寧上升的幅度(表6),表明4月23日嫁接后苗木由于水分充足,代謝旺盛,有利于消除單寧等酚類物質(zhì)的毒害.3山核桃嫁接成活率的主要影響因子大量的實(shí)驗(yàn)表明,嫁接植株的形成,包括初始粘連、愈傷組織的形成、貫穿砧木和接穗的維管束橋的形成等幾方面.在上述過程中,砧木和接穗內(nèi)部發(fā)生了許多生理生化變化.郭懷斌等1995研究表明,砧木和接穗的生活能力對愈傷組織的形成至關(guān)重要.細(xì)弱枝愈傷組織生長量小,成活率低.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:3月16日采集的穗條相應(yīng)的生理生化因子(除了單寧含量以外)都較其它2個(gè)時(shí)期采集的穗條高,單寧含量較低(表3),因此嫁接成活率高;同一穗條第3級至第5級側(cè)芽耐受傷害能力較強(qiáng),嫁接成活率較高(表1).趙元根等(1997)認(rèn)為溫度和濕度的適宜與否是山核桃嫁接成活的主要因子.溫度過高,濕度過低,接穗易失水干枯,溫度過低,傷口愈合速度緩慢.結(jié)果表明,4月3日嫁接時(shí),嫁接后的前9d,砧木含水量等都較低,而接穗缺乏水分的供應(yīng),又因外界環(huán)境干燥,失水嚴(yán)重,缺乏營養(yǎng)物質(zhì),多酚氧化酶活性等較低,雖然接穗與砧木間維管束已經(jīng)連結(jié),但砧穗2個(gè)接觸面上各種生活薄壁細(xì)胞還未脫分化形成愈傷組織,此時(shí)嫁接苗最易因外界環(huán)境的不適而死亡,因此必須加強(qiáng)管理.9d后,嫁接苗砧穗2個(gè)形成層中愈傷組織形成,相互對接,砧木不斷地向接穗輸送水分養(yǎng)分,接穗和砧木中的含水量等緩慢上升.而4月23日嫁接時(shí)砧木已經(jīng)萌動,新陳代謝旺盛,根系發(fā)達(dá),水分養(yǎng)分供應(yīng)能力強(qiáng)(表4),蛋白質(zhì)含量等都有較快地上升.因此,嫁接后前5d(比4月3日嫁接的苗木提早4d),接穗的含水量等生理生化因子就顯著升高,可供利用的水分養(yǎng)分越多,對細(xì)胞分裂有利,促進(jìn)愈傷組織的