果糖中氰化物的測定

銀杏是中國的古樹種之一。這是一種特殊的植物。在中國廣泛種植，產量占世界的70%。它是一種多用途的經濟樹種,集食品、藥材、木材、化妝品等原料和環境美化、綠化為一體。銀杏種子俗稱白果,為可食用部分,含較多的碳水化合物,其次為蛋白質、脂肪,還含有豐富的維生素、微量元素等。近年來,在白果的內胚乳中,分離出2種核糖核酸酶,故白果具有較高的營養價值。由于其營養豐富,自古以來被當作養生延年的上品,而現代已成為傳統的出口產品。據傳統中醫記載,白果主要藥用功效為斂肺氣、定喘嗽、止帶濁、縮小便,有治療哮喘、咳嗽、白帶、白濁、遺精、淋病、便頻等作用。現代研究也表明,白果具有明顯的抑制結核桿菌生長的作用;其中的羥基酚類具有抗癌和抗菌作用;白果蛋白具有抗衰老、抗疲勞、耐缺氧的作用;白果還能防治皮膚病,促進人體表皮細胞生長,延長表皮細胞壽命。故白果已成為除食品外醫藥、化妝品等的重要原料。但是,生食或食用加熱不透的白果達到一定量時,可能發生急性中毒,出現惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道癥狀,嚴重者還會死亡。大量學術研究資料顯示,引起白果不安全的因素主要是銀杏酚酸;也有一些國內資料認為白果中含有氰化物,但這方面的資料甚少。李曉莉等采用吡啶鹽酸聯苯胺比色法,測得湖北隨州產白果中氰化物(以氫氰酸計)含量為0.08mg/kg。張鋒倫測定龍眼白果中氫氰酸含量較高為0.521μg/gmf,大佛指白果中氫氰酸含量最低,為0.233μg/gmf。董立鑒報道采用碳酸鈉溶液處理新鮮的白果種子,可徹底脫除白果中所含的氰化物。但根據上述資料所采用的測定方法,這些氰化物含量如此小的數據值得商榷。所以有必要明確白果中是否含有氰化物及其含量,這對于全面了解白果的特性及其產品的安全控制具有重要意義。世界上約有2500種以上的植物含有氫氰酸,他們在植物體內以甙的形式存在,如分布于木薯、亞麻子以及白三葉草中的亞麻苦甙、存在于苦杏仁、黑櫻桃、大果西蕃蓮等中的苦杏仁甙以及野櫻皮甙。杏仁中含苦杏仁甙及苦杏仁酶,內服后,苦杏仁甙可被酶水解產生氫氰酸和苯甲醛,普通1g杏仁約可產生2.5mg氫氰酸。氰甙本身并沒有毒,但其進入人體后在β-葡萄糖甙酶的作用下水解產生劇毒的氰化氫,氰化氫能迅速地被血漿吸收和輸送,它能與鐵、銅、硫以及某些化合物中(在生存過程起重要作用)的關鍵成分相結合,抑制細胞色素氧化酶使之不能吸收血液中的溶液氧,當這些酶不起作用時,就會導致細胞窒息和死亡。其作用極為迅速,在含有很低濃度(0.005mg/L)氰化氫空氣中,很短時間內就會引起人頭痛、不適、心悸等癥狀;在高濃度(>0.1mg/L)氰化氫的空氣中能使人在很短的時間內死亡;在中等濃度時2~3min內就會出現初期癥狀,大多數情況下,在1h內死亡。氫氰酸經口鼻吸入致中毒,液體可經皮膚及眼結膜吸收致中毒。人口服的最小致死量為0.3~3.5mg/kg體重。英國和日本食品中氫氰酸的限量規定分別為15mg/kg和5mg/kg。我國GB16322-2003(植物蛋白飲料衛生標準)中規定蛋白飲料中氰化物的限量是0.5g/mL。目前,國內外對含氰植物的組織中總氰化物含量的測定方法有很多報道,其采用定性、定量方法測定氰甙的含量,其原理都是將氰甙等氰化物水解,而通過檢測水解釋放出的氫氰酸或葡萄糖的量來實現的。我國國標方法采用硝酸銀滴定法,雖然重復性比較差,但仍是經典的測定方法。普魯士藍法及苦味酸試紙法是國際上常用的快速定性檢測方法。本實驗采用幾種經典的氰化物檢測方法,以生的苦杏仁為對照,從定性和定量的角度,測定白果及其胚、胚乳中的氰化物,以期明確白果中氰化物的存在與否及其含量,為白果的安全性及其食用提供理論依據。1材料和方法1.1試驗用化學試劑白果:品種為大佛指,產于江蘇泰興,收獲后于(0±1)℃貯藏,取貯藏15、150、510d的白果進行分析測定,果實含水量52.33%;苦杏仁:市售,貯藏時間分別為150d和510d,含水量3.24%。硫酸亞鐵(FeSO4)、氫氧化鈉(NaOH)、硫酸(H2SO4)、鹽酸(HCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氨水、碘化鉀(KI)、硝酸銀(AgNO3)、酒石酸(2,3一二羥基丁二酸)、無水乙醇、碳酸鈉(Na2CO3):分析純,南京化學試劑公司;苦味酸:分析純,汕頭市西隴化工廠。1.2混合均一劑溶液稱取苦杏仁5g,白果全果、白果胚及白果胚乳均為8g,置于冰浴中研磨成粉末狀或漿狀,置于250mL三角錐瓶中,依次加入蒸餾水20mL混合均勻。取定性濾紙1張,在其中心部位滴加新配制的20%FeSO4溶液2滴和10%NaOH溶液1滴,接著往三角瓶滴加5滴10%H2SO4,立即將滴有FeSO4溶液和NaOH溶液的濾紙覆蓋在三角瓶上,并使濾紙上濕痕對正瓶口,然后將三角瓶在酒精燈下緩緩加熱,使瓶內蒸氣與濾紙上濕痕充分接觸,加熱30min,觀察濾紙的顏色變化。1.3干燥瓶的制備苦味酸試紙的制備:取定性濾紙剪成長7cm、寬1cm,入飽和苦味酸的乙醇溶液中浸泡5min取出,在室溫中陰干,儲存于干燥塑料瓶中備用。稱取苦杏仁5g,白果全果、白果胚及白果胚乳均為8g,置于冰浴中研磨成粉末狀或漿狀,置于250mL三角錐瓶中,加入蒸餾水20mL混合均勻,向其中加2g固體酒石酸,立即塞上懸有苦味酸試紙的膠塞,置于50℃水浴中恒溫30min,觀察試紙條的顏色變化。1.4氫氰酸含量的測定參考中華人民共和國國家標準豆類配糖氫氰酸含量的測定(GB/T15665-1995)。稱取20g試樣,精確至0.1g,置于1000mL凱氏瓶中,加入50mL水和10mL2%(w/v)的磷酸二氫鉀溶液,塞緊瓶口,充分混勻,將其放在38℃培養箱中水解12h。將水解后的試樣,置冰浴上冷卻20min,加入80mL水和1滴正辛醇(消泡作用),立刻將凱氏瓶連接到蒸餾裝置,使冷凝管下端浸入盛有20mL氫氧化鈉溶液的錐形瓶液面下,通入蒸氣進行蒸餾,收集100~150mL餾出液。取下錐形瓶時,沖洗冷凝管末端,將餾出液轉移到250mL容量瓶中,定容。移取2份100mL餾出液分別置于2個錐形瓶中,加2mL5%(w/v)的碘化鉀溶液和1mL6mol/L的氨溶液,混勻,在黑色背景襯托下,用0.004mol/L的硝酸銀標準溶液滴定,直至出現持續渾濁沉淀為終點。用蒸餾水代替餾出液作為空白實驗。氰化物含量的計算按下列公式計算:式中:X為樣品中氫氰酸的含量,μg/g;m為樣品質量,g。2結果與分析2.1熱壓時間對苦杏仁濾紙的影響普魯士藍法測定白果中氰化物的定性分析結果如圖1所示。蒸餾之前濾紙僅為水浸濕狀,蒸餾過程中不同處理出現不同的顏色變化。苦杏仁組的濾紙在加熱8min就開始出現絲狀亮藍色,隨著加熱時間的延長,絲狀亮藍色面積迅速增大,相互連在一起呈現片狀亮藍色,到加熱30min,苦杏仁組的濾紙上的全部濕痕變成藍色(圖1a),說明苦杏仁中有氰化物的存在。白果全果、白果胚及白果胚乳的3個組別中,隨著繼續加熱,濾紙上的水浸狀濕痕變為淡黃色,繼而淡黃色逐漸加深,變為深黃色,但一直未見如苦杏仁組的亮藍色出現,有些處理出現黃綠色(如圖1b、圖1d),但這些顏色出現在濾紙與三角瓶口的接觸處或三角瓶口外,且顏色與苦杏仁組的顏色不同,故認為該顏色不是氰化物所致。此方法從定性上判斷供試白果中無氰化物存在。2.2苦杏仁組的蒸餾時間苦味酸試紙法測定氰化物的反應中,若試紙條變成紫紅色,為氰化物反應陽性,若不變色表示陰性或低于最低檢出靈敏度(0.04mg/L)。由圖2可知,在蒸餾3min時,苦杏仁組的濾紙條就開始變為鮮紅色,隨著蒸餾時間的延長,紅色逐漸加深,到蒸餾20min紅色加深至肉眼判斷不變色,呈現深紅色,直至蒸餾末(30min),(如圖2a);而白果全果、白果胚及白果胚乳的試紙條從蒸餾開始到結束,濾紙條均為原來的黃色,無任何顏色變化。該檢測方法可用來定性測定食品中氰化物的存在,供試白果中沒有檢測到氰化物的存在。2.3酶活劑mg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/lg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hg/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/hs/gc/h通過硝酸銀滴定法測定苦杏仁中氫氰酸含量為216.81mg/kg。而在滴定過程中,白果、白果胚乳及白果胚的滴定情況幾乎與空白一致,故認為其中不含氫氰酸或氫氰酸含量無法檢出,結果見表1。3硝酸銀滴定法和氰離子選擇電極法普魯士藍法檢測靈敏度高,常作為氰化物的確證檢測方法,廣泛應用于植物中氰化物的檢測中。該法的原理是含有氰化物的物質在強酸作用下生成HCN,HCN與Fe2+結合生成[Fe(CN)6]4-,[Fe(CN)6]4-再與Fe3+(來自FeSO4中Fe2+被空氣氧化的產物)生成藍色的Fe4[Fe(CN)6]3,即普魯士藍。陳文華等(2007)應用普魯士測試斑點形成法,測得標準物氰化鉀的檢出極限是150μg/L或2.3μmol/L。在本實驗中,苦杏仁組的濾紙在加熱8min就開始出現亮藍色,但是3個白果組加熱30min都沒有該現象,根據上述氰化鉀的檢出極限(150μg/L),可推斷白果的3個組別中的氫氰酸含量至少是低于4.7mg/kg鮮質量。苦味酸試紙法也是定性快速檢測氰化物的常用方法。氰化物遇酸產生氫氰酸,氫氰酸與苦味酸鈉作用生成紅色異型紫酸鈉。賴玲揚等用苦味酸試紙法快速檢驗水中氰化物,認為方法簡單,操作方便、快速,半個多小時可得出結果,該法檢出靈敏度可達0.04mg/L,若水樣經蒸餾和濃縮,靈敏度可達0.008mg/L。林玉桓在生產杏仁飲料中,采用苦味酸試紙檢測其杏仁飲料,未發現濾紙條上出現棕紅色,認為該飲料不含氫氰酸,是安全的。在本實驗中,推斷3個白果組別中氰化物含量應該低于1.25mg/kg鮮質量。硝酸銀滴定法也是國標法(GB/T15665-1995)豆類-配糖氫氰酸含量的測定方法,其原理是豆類中配糖體氫氰酸經水解后,進行水蒸氣蒸餾,蒸出的氫氰酸被堿液吸收,以碘化鉀作指示劑,用硝酸標準溶液滴定氫氰酸,銀離子首先與氫氰酸根離子絡合反應,形成可溶性絡合物[Ag(CN)2]-,到達終點時,多余的硝酸銀與碘離子反應,生成持續渾濁沉淀,指示終點,以消耗硝酸銀標準溶液的用量,計算氫氰酸的含量。該法是生產中測定食品中氰化物的經典方法,且因其不涉及劇毒品氰化鉀標準樣,因此也常應用于研究中氰化物的定量測得,但適用于分析液濃度在1mg/L以上。本實驗中,此法測得苦杏仁中氫氰酸含量為216.81mg/kg,但是白果組的樣品都未能測到,可推斷白果組中氰化物含量可能低于12.5mg/kg鮮質量,故未能檢出。綜合本實驗應用的植物種子中氰化物測定的3種方法,苦味酸試紙法反應最為迅速,顏色變化非常明顯、清晰,且操作簡單,適用于生產和研究中的快速定性檢測。普魯士藍法的顏色變化也比較明顯,只是在濾紙和三角瓶口接觸的地方容易有黑藍色出現,該顏色雖異于普魯士藍,但給實驗結果的判斷,特別是樣品中氰化物含量較低情況下的測定造成影響。硝酸銀法作為國標方法安全易操作,但其檢測靈敏度較低,且滴定終點的判斷較為微妙,穩定性較差,需經過多次滴定來確定。此外,在研究和應用中,測定氰化物還有其他方法。比色法的靈敏度較高,其分析液濃度下限為0.02mg/kg。但該法需要氰化鉀標準品作為標準樣,由于該樣品為劇毒品,所以該方法在分析測定應用中受到限制。鄧紹平等(2008)采用巴比妥酸-異煙酸比色法(檢測限為0.1mg/kg)測定苦杏仁中的總氰化物含量為330mg/kg,,但沸水煮15min后,總氰化物含量降低98%(7.3mg/kg)。而李曉莉等采用吡啶鹽酸聯苯胺比色法,測得湖北隨州產白果中氰化物(以氫氰酸計)含量為0.08mg/kg。氰離子選擇電極法也是一種定量測量方法,其原理為在pH12、0.1mol/L的硝酸鉀介質中,氰離子濃度在10-1~10-6mol/L之間,電位值與氰離子濃度負對數呈線性關系,可以求出樣品中氰化物的含量。其分析濃度范圍為0.05~10mg/L。Yeoh等采用β-葡萄糖甙酶電極法測得木薯屬的18種植物的亞麻苦甙含量為24~395mg/100g,認為方法既簡便可靠又不需要分光光度計法中所需要的有毒化學物質,可以在15~20min內檢測出亞麻苦甙的含量,且最低檢出限為0.1mmol/L。白果中氰化物的存在與否及其含量存在爭議。中國作為白果的主產地,食用白果的歷史較長,其引起的中毒事件也較頻繁,即使食用十幾粒即能引起中毒,而煮制過的白果攝入過多也會引起中毒,該現象與杏仁中毒相似,因此一些報道認為白果中毒主要是氰化物引起的。但查閱國外文獻,均認為白果的不安全主要是其中的銀杏酚酸類物質或4-MPN引起,未見關于白果氰化物的報道。陳鵬等(1989)應用離子計和標準加入法測得發芽白