不同濾紙對齦溝液收集的影響

牙齦出血（tcf）是牙齦組織的滲出物。它的成分來自血清和牙齦組織的局部。近年來,對于齦溝液的研究除了其分泌量以及各成分的變化與牙周炎癥的相關性之外,越來越多地涉及口腔正畸、口腔修復、口腔種植及其與系統性疾病的相互關系等方面。Page認為,齦溝液作為檢測患者牙周病易感程度的主要研究樣本之一最具潛力。Javed等指出,對種植體周圍齦溝液(peri-implantcrevicularfluid,PICF)中細胞因子水平的監測,有助于檢測尚未出現臨床癥狀的早期炎癥。齦溝液采集是對齦溝液進行相關研究的基礎。齦溝液采集方法一般有齦溝液沖洗法、微吸管法和濾紙條法,其中,以濾紙條法最為常用。齦溝液的定量方法有茚三酮染色法、稱重法、檢測齦溝液在濾紙條上的遷移距離和使用齦溝液測量儀(Periotron)。其中,使用齦溝液測量儀最為精確方便,但其價格昂貴且檢測范圍小,如Periotron8000檢測的理想范圍為0.1~1.2μL,這些都限制了Periotron在臨床上的應用。目前,我國多采用自制濾紙條采集齦溝液樣本[2,3,4,5,12,13,14,15]。本研究通過體外實驗,對whatman3MM層析濾紙和whatman3#定性濾紙在收集齦溝液及蛋白萃取等方面進行比較,為臨床研究中選用合適濾紙采集齦溝液提供實驗依據。1材料和方法1.1蛋白濃度測定whatman3MM層析濾紙(Whatman,英國);whatman3#定性濾紙(Whatman,英國);正常人血清;0.9%NaCl溶液(上海長征富民金山制藥有限公司,中國);品紅溶液;0.5mLEp管(Axygen,美國);BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(碧云天生物技術研究所,中國);0.1~2.5μL、2~20μL、20~200μL和100~1000μL量程的微量加樣器(Eppendorf,德國);96孔板(Corning,美國);Zeiss立體顯微鏡(Zeiss,德國);WH-1微型漩渦混合儀(金壇市盛藍儀器制造有限公司,中國);TOMOSMiniStar微型迷你離心機(上海托莫斯科學儀器有限公司,中國);恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司,中國);BioRad2550自動酶標儀(Bio-Rad,美國)。1.2方法1.2.1濾紙的制備將whatman3MM層析濾紙和whatman3#定性濾紙裁成2mm×8mm大小的濾紙條,置于干凈容器中備用。whatman3MM層析濾紙設為A組,whatman3#定性濾紙設為B組。1.2.2血清品紅溶液添加量觀察在正常人血清中滴入少量品紅溶液,使其染色便于觀察。使用微量加樣器,在各組15個樣本上依次加入0.1~1.5μL血清品紅溶液(0.1μL依次遞增)。Zeiss立體顯微鏡下觀察,SPOT4.6軟件拍照、測量每張濾紙條上溶液浸潤長度,重復4次。計算獲得浸潤長度與溶液體積的相關性,并比較2種濾紙的差異。1.2.3血清中pacl的濃度使用微量加樣器在A、B組濾紙條上分別依次加入0.3、0.6、0.9、1.2、1.5μL正常人血清。同體積重復5次。將各濾紙條分別浸于盛有200μL0.9%NaCl溶液的Ep管中,靜置30min。震蕩5min,離心1min。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)測定各萃取液的總蛋白濃度,比較2組差異。1.2.4血清萃取及蛋白濃度測定用0.9%NaCl溶液將正常人血清等倍稀釋,獲得5個不同濃度(C16、C/8、C/4、C/2、C)的血清溶液。使用微量加樣器在A、B組濾紙條上分別依次加入5種濃度的血清溶液1μL。同濃度重復5次。萃取及蛋白濃度測定方法同1.2.3。比較2組差異。1.3統計學分析實驗數據以x±s表示,采用SPSS17.0軟件包進行統計學分析。溶液浸潤長度與溶液體積的關系采用線性回歸分析,2組差異采用方差分析,P<0.05為差異具有顯著性。2結果2.1濾紙條中溶液浸漬長度與溶液體積相關性分析A、B2組溶液浸潤長度與溶液體積的擬合曲線見圖1、2。圖1中,R2=0.995,圖2中,R2=0.995,表明A、B2組濾紙條中溶液浸潤長度與溶液體積均呈良好的線性關系。表1為A、B2組濾紙條中溶液浸潤長度與溶液體積相關性的比較。溶液體積為0.1μL時,溶液平均浸潤長度A<B,其余各體積均A>B。經方差分析,2組溶液浸潤長度有顯著差異(P<0.05)。2.2蛋白萃取性能測定表2為相同濃度、不同體積正常人血清A、B2組濾紙條的蛋白萃取性能比較結果。經方差分析,A、B2組的萃取液總蛋白濃度無顯著差異(P>0.05)。2.3濾紙條的萃取性能測定表3為相同體積、不同濃度正常人血清A、B2組濾紙條的蛋白萃取性能比較結果。經方差分析,A、B2組的萃取液總蛋白濃度差異無統計學意義(P>0.05)。3濾紙條的蛋白回收性能測定已發現齦溝液含有幾十種成分,目前,對于齦溝液的研究包括口腔修復學、牙周病學、口腔正畸學、口腔種植學及其與系統性疾病的相互關系等多個領域。國內在對齦溝液的研究中,多使用溝內法采集齦溝液,但所選用的濾紙種類不一,常見的有whatman1#定性濾紙、whatman3#定性濾紙、whatman3MM層析濾紙等。究竟哪種濾紙在采集齦溝液方面性能更優,研究中選用哪種濾紙均需要實驗依據。陳智濱等通過比較吸潮紙尖與傳統濾紙條采集齦溝液樣本質和量的差異,認為吸潮紙尖可以替代傳統手工裁剪的濾紙條。但目前國內外眾多對于齦溝液的研究中,使用濾紙作為采樣材料仍為主流。Griffiths等對periopaper(Harco)、whatman1#層析濾紙、whatman4#層析濾紙和whatman3MM層析濾紙4種濾紙進行比較,認為2mm×8mm大小的whatman3MM層析濾紙條對血清蛋白的回收率最高。Johnson等對whatman1#濾紙、whatman3MM層析濾紙、periopaper(ProFlow)和periopaper(Harco)4種濾紙條蛋白回收性能進行比較,認為不同濾紙條對蛋白的洗提和回收的效率不同,whatman濾紙優于periopaper濾紙,并指出早先各研究小組間實驗數據的差異可能與GCF蛋白從濾紙條上不完全洗提有關,而這種不完全洗提歸因于蛋白在濾紙條上的黏附和濾紙條對蛋白的截留。本研究中,A組whatman3MM層析濾紙和B組whatman3#定性濾紙的溶液浸潤長度與溶液體積均呈現良好的線性關系,表明可采用齦溝液在濾紙條上的遷移距離來對所采集的齦溝液進行定量。2組溶液浸潤長度的差異具有統計學意義,除體積為0.1μL時,A組濾紙條上的溶液浸潤長度均大于B組,表明相同大小的2種濾紙條,whatman3#定性濾紙所收集的齦溝液量大于whatman3MM層析濾紙。根據Whatman公司產品介紹中所給出的數據,A的厚度為0.34mm,B的厚度為0.39mm。因此,理論上,相同大小的2種濾紙條所收集的齦溝液量B大于A,與實驗結果相符。可以認為,當齦溝液分泌量較大,相同時間內所采集的齦溝液樣本較多,如牙周炎癥較重時,選用whatman3#定性濾紙優于whatman3MM層析濾紙。個體的齦溝液總蛋白濃度不同,且單位時間內齦溝液的分泌量也不同,又因齦溝液是血清的滲出液,因此,本實驗采用相同濃度不同體積以及相同體積不同濃度的正常人血清溶液對A、B2種濾紙的蛋白萃取性能進行比較。結果顯示,2組的萃取液總蛋白濃度無顯著差異。這可能與2種濾紙的顆粒保留孔徑大小相近,對蛋白的截留性能接近有關。蛋白質的黏附特性隨濾紙種類的不同而有所差別,濾紙的蛋白萃取效率與濾紙的種類及蛋白的濃度密切相關。本實驗A、B2組所使用的蛋白溶液相同,為同一正常人血清或血清溶液,且根據Whatman公司產品介紹,兩者均為纖維素類濾紙。因此,whatman3MM層析濾紙和whatman3#定性濾紙對相同蛋白溶液的萃取效率無顯著差別。綜上所述,whatman3MM層析濾