特異性cr基因轉染細胞的分化及抗腫瘤免疫功能研究

對于過度細胞疾病，主要指對骨腫瘤主體內的免疫細胞進行回輸，如細胞毒性t細胞和腫瘤浸潤細胞，以增強和重建腫瘤的免疫。然而目前將過繼性細胞治療廣泛應用于大多數非病毒相關實體瘤還有不少問題亟待解決。如:(1)如何獲得充分數量的腫瘤反應性T細胞。(2)回輸體內的免疫細胞難以長期存活,極大影響了抗腫瘤療效。由于腫瘤患者T細胞對與自身抗原接近的腫瘤抗原耐受,對大多數患者而言,難以從其體內獲得可識別腫瘤抗原的反應性T細胞。基因工程技術為此提供了全新的解決途徑。即首先鑒定可特異性識別腫瘤抗原的T細胞受體(Tcellreceptor,TCR)基因,再將編碼腫瘤特異性TCR的基因導入成熟T細胞,最終獲得TCR基因修飾T細胞。特異性TCR基因修飾T細胞可有效識別抗原陽性腫瘤細胞,進而發揮免疫效應。目前多數TCR基因轉染T細胞治療使用CD8+T細胞進行擴增、基因轉染與回輸。然而,通過觀察回輸患者體內后的長期療效,研究者發現CD8+T細胞的抗腫瘤效果通常由于其回輸體內后生存能力較弱而受到極大的限制。作為機體維持免疫記憶的主要基礎之一,記憶性T細胞可在免疫應答結束后長期存活于體內。與遭遇抗原初次刺激的幼稚性T細胞相比,記憶性T細胞通過保持抗原識別特異性,可在再次遭遇相同抗原時發揮更為快速強烈的免疫效應。從而為機體提供長期免疫保護。本研究擬以本實驗室之前篩選的肝癌特異性TCR基因為基礎,研究TCR基因修飾T細胞被腫瘤抗原激活后,記憶性T細胞的分化情況,并明確其表型特征和免疫功能,為獲得兼具腫瘤識別特異性及長期體內生存能力的T細胞亞群用于過繼性細胞治療提供必要實驗基礎。1材料和方法1.1材料表面1.1.1mcf-7hla-2、afp–2人胚腎細胞系膜見表1人源性肝癌細胞株HepG-2(HLA-A2+、AFP+),SMMC-7721(HLA-A2+、AFP+),人源性乳腺癌細胞株MCF-7(HLA-A2+、AFP–),人TAP缺陷型T2細胞,人胚腎細胞系HEK-293均為本實驗室保存;重組腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV(將TCRVα12.2,Vβ7.1基因片段以IRES連接,并構建至嵌合型Ad5/35型腺病毒載體)由本室構建保存。1.1.2細胞培養抗菌藥1640培養基、胎牛血清為美國Gibco公司產品;人淋巴細胞分離液為天津灝洋生物制品科技有限責任公司產品;重組人IFN-γ購自德國BoehringerIngelheim公司;重組人IL-2、鼠抗人CD3單克隆抗體、鼠抗人CD28單克隆抗體為美國R&D公司產品;HLA-A2+AFP218-226表位9肽(LLNQHACAV)由杭州中肽生化有限公司合成;MTT購自美國Sigma公司;PE標記抗人TCRVβ7抗體、PC5標記抗人CD3抗體、PC5標記抗人CD8抗體、FITC標記抗人CD62L抗體、PE標記抗人CD44抗體、ECD標記抗人CD45RO抗體均購自美國BioLegend公司;FITC標記抗人TCRVα12抗體為美國Endogen產品;AnnexinV-PI細胞凋亡檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術有限公司;人IFN-γELISA檢測試劑盒、人IL-2ELISA檢測試劑盒購自深圳達科為生物技術有限公司。1.2方法1.2.1分離和提取人類pbmc取HLA-A2陽性健康人外周血,Ficoll-Hapaque密度梯度離心法分離PBMC。1.2.2抗單克隆抗體oht3,5.分離獲得的PBMC在添加10%胎牛血清、雙抗(青霉素100U/ml,鏈霉素100μg/ml)的RPMI1640完全培養液中培養。分離后第1天,以抗人CD3單克隆抗體(OKT3,30ng/ml),抗人CD28單克隆抗體(1ng/ml)及重組人IL-2(300IU/ml)完成刺激。此后每3天半量換液,并補加重組人IL-2(終濃度為50IU/ml)。1.2.3胰腺疾病的復發1.2.5免疫組織中cd62l、pe標記、ecd標記抗人cd45ro抗體檢測T細胞標志分子表達各組細胞到達預定時間后,FITC標記抗人CD62L抗體、PE標記抗人CD44抗體、ECD標記抗人CD45RO抗體染色,流式細胞術檢測以上3種分子表達陽性細胞比例。PC5標記抗人CD3抗體框選T細胞以排除雜細胞干擾。1.2.6tcr基因轉染t細胞并活性成分檢測將各組腫瘤細胞(HepG-2、SMMC-7721、MCF-7)濃度調節至1×105個/ml,接種于96孔板,100μl/孔。將以下各組效應細胞加至靶細胞:(1)PBMC對照組;(2)抗原刺激PBMC組;(3)TCR基因轉染T細胞組;(4)TCR基因轉染T細胞+抗原刺激組。效靶比分別為3:1、10:1、30:1。并設淋巴細胞對照組(只加入相應淋巴細胞)、靶細胞對照組(只加入靶細胞)、最大裂解組(加MTT1h前加入1%TritonX-100,以徹底裂解靶細胞,作為陽性對照)。各組設5復孔。效應細胞與靶細胞共培養4h后,加入MTT(5mg/ml)10μl/孔。37℃孵育4h。棄上清,10%SDS徹底溶解甲瓚結晶。酶標儀測570nm處OD值。并按以下公式計算各組細胞腫瘤殺傷活性:腫瘤細胞殺傷百分比=(實驗組OD-淋巴細胞對照組OD)/(最大裂解組OD-靶細胞對照組OD)×100%。1.2.7cd3-pc5熒光抗體染色將腫瘤細胞HepG-2濃度調節至2×105個/ml,接種于6孔板(1ml/孔)。分別加入各組效應細胞,效靶比為30:1,共培養4h。按說明書操作完成樣本制備后上機。CD3-PC5熒光抗體染色排除T細胞后,以FITC單染為早期凋亡細胞,PI-FITC雙染為晚期凋亡/死亡細胞,PI單染為死亡細胞,雙陰性細胞為正常細胞。統計各類細胞比例。1.2.8細胞培養和il-2含量檢測將腫瘤細胞HepG-2與SMMC-7721濃度調節至2×105個/ml,接種于96孔板,100μl/孔。分別加入各組效應細胞,效靶比為30:1,共培養24h。到達預定培養時間后,收集各組細胞培養上清液,雙抗體夾心ELISA法檢測IFN-γ與IL-2含量。操作按ELILSA試劑盒說明書進行。根據酶標儀測量的樣本吸光度A450值和標準曲線計算IFN-γ和IL-2濃度。1.3統計分析方法實驗數據以ue0af±s表示。應用SPSSv16.0軟件進行統計分析。采用單因素方差分析比較各組差異。當P<0.05時,被認為差異具有統計學意義。應用GraphPadPrism5.0軟件繪圖。2結果2.1tcr基因外源在t細胞上的表達情況以MOI=100轉染PBMC后,以CD3、TCRα12、TCRVβ7熒光抗體標記,流式細胞術檢測了外源TCR基因在T細胞表面的表達情況(圖1)。結果顯示,轉染3d后,TCRVα12+Vβ7+細胞在T細胞中的比例(29.7%)高于未轉染對照組(<3%)。證實外源TCR基因可有效表達于T細胞。隨著培養時間的延長,TCRVα12+Vβ7+細胞比例逐漸降低。轉染7d,TCRVα12+Vβ7+細胞比例下降約一半(15.7%);轉染14d,下降至高峰的約五分之一水平(5.8%)。2.2抗原刺激后，腫瘤特定tr基因轉化瘤的表型特征2.2.1抗原刺激對t細胞活化的影響TCR基因轉染促進T細胞活化CD45RO同時表達于記憶性T細胞與活化T細胞表面,可以作為T細胞識別抗原后活化的標記。圖2顯示,單獨培養的PBMC中CD45RO+細胞比例始終保持在較低水平(<1%)。在腫瘤抗原刺激下,T細胞的活化使CD45RO+細胞比例略有上升。腫瘤特異性TCR基因轉染后抗原刺激使T細胞的活化比例進一步提高。T細胞活化程度的顯著增強提示特異性TCR基因轉染可促進T細胞識別腫瘤抗原繼而活化。隨著抗原刺激后培養時間的延長,CD45RO+細胞比例逐漸上升。至抗原刺激活化后14d,腫瘤特異性TCR基因轉染T細胞經抗原刺激組中CD45RO+細胞比例上升至接近T細胞總體水平的一半。2.2.2cd62l+細胞的表型框選TCR基因轉染并經腫瘤抗原刺激組中的CD45RO+細胞,CD62L、CD44雙熒光抗體染色分析CD45RO+細胞表型。結果顯示C45DRO+細胞中主要以CD62L–CD44+表型細胞為主。值得注意的是,隨著抗原刺激后時間的延長,CD62L+細胞在CD45RO+細胞中比例逐漸上升。從而使CD62L+CD44+細胞在CD45RO+細胞中的比例逐漸增加,并形成了明顯的CD62L+CD44+細胞分群(圖3)。2.3.1tcr基因轉染對t細胞殺菌活性的影響將各組效應細胞(PBMC對照組、抗原刺激組、TCR基因轉染組、TCR基因轉染+抗原刺激組)以不同效靶比(3:1、10:1、30:1)作用于不同腫瘤細胞株。4h后以MTT法檢測了各組效應細胞腫瘤殺傷活性。如圖4A所示,PBMC組和抗原刺激組在各效靶比對肝癌細胞株HepG-2的腫瘤殺傷活性的差異均無統計學意義(P>0.05)。特異性TCR基因轉染后,T細胞的腫瘤殺傷活性上升,在各效靶比與PBMC對照組及抗原刺激組差異均有統計學意義(P<0.001)。值得注意的是,TCR基因轉染+抗原刺激組在效靶比10:1和30:1時,腫瘤殺傷活性與TCR基因轉染組相比差異有統計學意義(P<0.001)。在各組細胞作用于肝癌細胞株SMMC-7721后也獲得了類似的結果(圖4B)。TCR基因轉染T細胞的殺傷活性在各效靶比與PBMC對照組及抗原刺激組差異均具有統計學意義(P<0.001)。TCR基因轉染+抗原刺激組在效靶比10:1和30:1時,腫瘤殺傷活性與TCR基因轉染組相比差異有統計學意義(P<0.001)。與作用于肝癌細胞系不同的是,各組效應細胞作用于乳腺癌細胞MCF-7之后(圖4C),在各效靶比的腫瘤殺傷活性的差異均無統計學意義(P>0.05)。以上結果提示特異性TCR基因轉染可有效促進T細胞識別殺傷抗原陽性腫瘤細胞,并具有良好的抗原特異性。2.3.2細胞凋亡比例以AnnexinV-PI雙染法進一步檢測了不同組效應T細胞(PBMC對照組,腫瘤抗原刺激組,TCR基因轉染組,TCR基因轉染+抗原刺激組)以效靶比30:1作用HepG-2細胞4h后,靶細胞凋亡比例。CD3-PC5熒光抗體染色排除T細胞后,以PI單染為死亡細胞,AnnexinV單染為早期凋亡細胞,AnnexinV-PI雙染為晚期凋亡細胞。如圖5結果所示。與對照組T細胞相比,靶細胞凋亡比例<1%(圖5A),TCR基因轉染T細胞作用后,靶細胞凋亡比例上升至18%(圖5C)。在TCR基因轉染+抗原刺激組T細胞的作用下,靶細胞凋亡比例進一步增加至34.2%(圖5D)。2.4elisa法檢測細胞因子含量為進一步分析T細胞抗腫瘤免疫機制,各組細胞作用于靶細胞HepG-2及SMMC-7721(效靶比30:1)24h后,ELISA法檢測了上清中細胞因子含量。2.4.1tcr基因轉染+抗原刺激對小鼠血清ifn-的影響如圖6結果所示,TCR基因轉染可促進T細胞作用于靶細胞HepG-2后IFN-γ分泌。與PBMC對照組(3.736±0.412)ng/ml相比,TCR基因轉染組IFN-γ含量(25.962±2.488)ng/ml顯著上升(P<0.001)。同時,TCR基因轉染+抗原刺激組T細胞IFN-γ含量(33.394±2.520)ng/ml顯著高于抗原刺激組(5.318±1.164)ng/ml(P<0.001)。值得注意的是,TCR基因轉染+抗原刺激組IFN-γ含量與TCR基因轉染組相比差異有統計學意義(P<0.001)。檢測各組效應細胞作用于靶細胞SMMC-7721后上清中IFN-γ含量,獲得了類似的結果。TCR基因轉染組IFN-γ分泌(24.688±1.220)ng/ml顯著高于PBMC對照組(3.324±0.334)ng/ml(P<0.001),TCR基因轉染+抗原刺激組T細胞IFN-γ含量(30.930±2.825)ng/ml顯著高于抗原刺激組(5.006±0.645)ng/ml(P<0.001)。同時,TCR基因轉染+抗原刺激組IFN-γ含量與TCR基因轉染組相比差異有統計學意義(P<0.001)。以上結果提示TCR基因轉染和抗原刺激均可有效促進T細胞分泌細胞因子IFN-γ。3cd45ro+細胞在抗原刺激后t細胞的表達發生了變化特異性TCR基因修飾T細胞為過繼性細胞治療提供了一種靶向性強的治療策略。在本研究中,我們以之前篩選的肝癌抗原特異性TCR基因為腫瘤抗原識別基因,以改造的嵌合型腺病毒載體Ad5F35-TRAV-TRBV為基因轉染工具,對來源于PBMC的T細胞進行了基因修飾。并以腫瘤抗原進一步刺激基因修飾T細胞,觀察了經TCR基因轉染和抗原刺激后T細胞表型和功能變化。實驗結果顯示,重組腺病毒Ad5F35-TRAV-TRBV可有效感染T細胞。考慮到腺病毒是一種瞬時轉染載體。我們追蹤了外源TCR基因轉染后在T細胞表達水平的時間變化。結果顯示。在腺病毒感染T細胞3d后,外源性TCR基因表達水平最高(接近30%)。隨著培養時間的延長,外源TCR基因表達水平逐漸下降。至培養14d后下降至表達高峰的五分之一。在今后實驗中,我們擬通過改造啟動子,以細核酸病毒核糖體肽取代IRES連接α、β基因、去除糖基化位點等技術改造載體,以進一步提高外源TCR基因的表達水平和穩定性。未經抗原刺激時,無論是否進行TCR基因轉染,PBMC中CD45RO+細胞比例始終保持在較低水平。在腫瘤抗原刺激下,T細胞的活化使CD45RO+細胞比例略有上升。這一效果可能是因為來源于健康人供者的多克隆T細胞抗原識別池中部分可識別腫瘤抗原的T細胞發生了活化和擴增。腫瘤特異性TCR基因成功表達于T細胞表面后,有效促進了T細胞識別腫瘤抗原進而充分活化。CD45RO+細胞比例顯著高于未轉染組刺激后水平。隨著抗原刺激后培養時間延長,CD45RO+T細胞比例呈逐漸上升趨勢。在刺激后14d接近50%。這一周期與T細胞活化后擴增期時間長度一致。盡管CD45RO被認為是鑒定記憶性T細胞的經典標記。但僅以CD45RO表達與否區分幼稚性T細胞和記憶性T細胞不夠精確。這是因為CD45RO細胞可能同時表達在抗原活化的效應性T細胞表面,并再轉變回CD45RA+表型。同時,記憶性T細胞還包括效應型記憶性T細胞(TEM)和中樞型記憶性T細胞(TCM)兩個亞群,它們的表型、歸巢能力和效應功能截然不同。因此,除以CD45RO表達初步評價T細胞活化和記憶性T細胞分化趨勢之外。我們還采用了CD62L和CD44分子進一步分析了記憶性T細胞亞群。其中CD62L是重要的歸巢受體,可以通過表達與否區分TCM和TEM。而CD44在記憶性T細胞表面表達水平顯著高于幼稚性T細胞,其功能是作為黏附分子,促進T細胞與抗原遞呈細胞的相互作用,并可促進記憶性T細胞穿越血管壁歸巢至局部淋巴結。通過檢測CD45RO+細胞在抗原刺激后不同時間點的表型,我們發現T細胞在體外被活化后,主要表現為CD62L–CD44+表型。這是效應型T細胞(包括TEM)的特征表型。值得注意的是,伴隨著抗原刺激后時間的延長,在CD45RO+細胞比例逐漸上升的同時,CD62L+CD44+即中樞型記憶性T細胞(TCM)的比例逐漸增加,并逐漸形成了較為明顯的細胞亞群。這一結果提示,通過TCR基因轉染促進T細胞被抗原刺激活化,能夠有效啟動記憶性T細胞的分化進程。其中部分記憶性T細胞可以逐漸分化獲得CD62L+CD44+中樞型記憶性T細胞表型。在經TCR基因轉染修飾及抗原AFP刺激后,我們檢測了各組效應T細胞的抗腫瘤免疫效應。結果顯示,特異性TCR基因轉染有效促進了T細胞識別殺傷AFP陽性腫瘤細胞,而對AFP陰性腫瘤細胞株無類似效果。同時,AFP抗原預先刺激可進一步提高TCR基因轉染T細胞對抗原陽性腫瘤細胞的殺傷活性。分析各組效應細胞誘導AFP陽性腫瘤細胞凋亡情況,獲得了與腫瘤殺傷實驗類似的結果。TCR基因轉染T細胞誘導AFP陽性靶細胞凋亡比例顯著增加,而AFP抗原的預先刺激進一步增強了T細胞促凋亡效果。以上結果提示,腫瘤特異性TCR基因轉染可有效促進T細胞以CTL效應、直接誘導凋亡等機制殺傷抗原陽性腫瘤細胞。而腫瘤抗原的預先刺激能進一步增強TCR基因轉染T細胞的抗腫瘤免疫效應。結合表型檢測結果,提示抗原刺激有效活化TCR基因轉染T細胞后,可能啟動了記憶性T細胞分化。含記憶性T細胞成分的T細胞在再次遭遇表達相同腫瘤抗原的靶細胞時有更強烈的免疫效應。實驗同時檢測了T細胞作用于靶細胞后細胞因子的分泌情況。TCR基因轉染促進了T細胞識別抗原后分泌IFN-γ。而抗原的預先刺激使TCR基因轉染T細胞IFN-γ的分泌能力進一步上升。而TCR基因轉染和腫瘤抗原預先刺激對T細胞分泌IL-2的能力沒有顯著影響。以上結果提示,IFN-γ是CTL細胞介導抗腫瘤免疫反應的關鍵細胞因子。而盡管IL-2能夠促進T細胞增殖,但是最近的研究顯示,IL-2在CTL活化過程中主要意義是標記T細胞效應分化,而非介導抗腫瘤免疫。Kaech和Ahmed在NatureImmunology上發表的一項關鍵性研究總結了抗原刺激對記憶性T細胞發育的影響。結果顯示,最佳的初次抗原刺激活化對記憶性T細胞分化極其重要,抗原充分刺激可以使數量盡可能多的T細胞被活化后進入效應分化程序。一旦T細胞被抗原有效活化,即可以啟動其內在分化程序,不間斷地沿效應性T細胞、記憶性T細胞的途徑分化,最終產生長壽命記憶性T細胞,并保持抗原特異性。我們的研究證實,通過腫瘤特異性TCR基因轉染能夠有效促進T細胞識別腫瘤抗原后活化,CD45RO+細胞比例逐漸上升,并通過啟動記憶性T細胞的分化過程,最終獲得分群明顯的CD62L+CD44+TCM表型細胞。Berger等以豚尾猴為模型的研究顯示,來源于TCM活化產生的效應型T細胞可在回輸動物體內后再次獲得TCM表型,