微生物程度檢查辦法學(xué)驗(yàn)證一、檢查辦法根據(jù)微生物計(jì)數(shù)法（中國(guó)藥典四部1105）；控制菌檢查法（中國(guó)藥典四部1106）；非無(wú)菌藥品微生物程度原則（中國(guó)藥典四部1107）；抑菌效力檢查法（中國(guó)藥典四部1121）檢查。二、菌種、培養(yǎng)基及稀釋液表1菌種菌種名稱菌種代數(shù)菌種狀態(tài)廠家大腸埃希菌[CMCC(B)44102]3正常浙江省食品藥品檢查研究院金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]3正常枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]3正常白色念珠菌[CMCC(F)98001]3正常黑曲霉[CMCC(F)98003]3正常乙型副傷寒沙門菌[CMCC(B)50094]3正常表2培養(yǎng)基培養(yǎng)基名稱批號(hào)廠家營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基150222北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司改良馬丁培養(yǎng)基150134北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基150215北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基150317北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基150323北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司膽鹽乳糖培養(yǎng)基150127北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基150214北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基150416北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司MUG培養(yǎng)基150122北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基150137北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基150207北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司表3對(duì)照用培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基名稱批號(hào)廠家營(yíng)養(yǎng)肉湯對(duì)照培養(yǎng)基13中國(guó)食品藥品檢定研究院營(yíng)養(yǎng)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基13中國(guó)食品藥品檢定研究院玫瑰紅鈉瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基13中國(guó)食品藥品檢定研究院膽鹽乳糖對(duì)照培養(yǎng)基13中國(guó)食品藥品檢定研究院膽鹽硫乳瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基13中國(guó)食品藥品檢定研究院四硫磺酸鈉亮綠對(duì)照培養(yǎng)基13中國(guó)食品藥品檢定研究院MUG對(duì)照培養(yǎng)基13中國(guó)食品藥品檢定研究院曙紅亞甲藍(lán)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基13中國(guó)食品藥品檢定研究院三糖鐵瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基表4試劑試劑名稱批號(hào)級(jí)別磷酸二氫鉀130826分析純氫氧化鈉0117分析純氯化鈉0714分析純聚山梨酯801011化學(xué)純95%乙醇15070722藥用級(jí)二甲氨基苯甲醛0402分析純鹽酸0533分析純稀釋液：（1）pH6.8緩沖液取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml,加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118ml,用水稀釋至1000ml，搖勻，既得。（2）0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過(guò)濾，分裝、滅菌。（3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液取聚山梨酯800.5ml，用0.9％無(wú)菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至1000ml，濾過(guò)，分裝，滅菌，備用。（4）靛基質(zhì)試液取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充足振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml漸漸滴入。三、菌液的制備1細(xì)菌、霉菌、酵母菌接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液（用帶有無(wú)菌棉花的能過(guò)濾菌絲的無(wú)菌毛細(xì)吸管）用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。2控制菌接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)。用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10～100cfu的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24小時(shí)內(nèi)使用。四、驗(yàn)證內(nèi)容1、計(jì)數(shù)辦法驗(yàn)證將制備好的菌懸液用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液以每10倍體積分別稀釋成一系列濃度菌懸液，運(yùn)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，擬定具體菌懸液濃度，取靠近于10cfu-100cfu的稀釋濃度，選用各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)下的規(guī)定濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。稀釋及觀察均應(yīng)在陽(yáng)性室內(nèi)完畢。通過(guò)驗(yàn)證當(dāng)原液稀釋至10-6時(shí)，菌液濃度靠近100cfu/ml。2、合用性檢查2.1細(xì)菌、霉菌、酵母菌取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1ml(內(nèi)含菌約50～100cfu)，分別注入無(wú)菌平皿中，立刻傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株實(shí)驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(內(nèi)含菌約50～100cfu)，注入無(wú)菌平皿中（取用黑曲霉時(shí)應(yīng)注意本身安全），立刻傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株實(shí)驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用對(duì)應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，作為對(duì)照。其大小、形態(tài)應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致，且數(shù)量應(yīng)不不大于對(duì)照培養(yǎng)基的70%。細(xì)菌、霉菌及酵母菌培養(yǎng)基合用性檢查培養(yǎng)基名稱菌種名稱測(cè)試培養(yǎng)基（cfu）對(duì)照培養(yǎng)基（cfu）回收率(%)大小形態(tài)原則結(jié)論碟1碟2平均碟1碟2平均營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌87838595999787.6一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌88828594989688.5一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定大腸埃希菌838684.595959588.9一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌848785.5999496.588.6一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌908688971019988.9一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定大腸埃希菌888385.5929995.589.5一致大小形態(tài)一致且回收率≥70%符合規(guī)定培養(yǎng)基中細(xì)菌、霉菌、酵母菌的生長(zhǎng)狀況良好，回收率在80%，且與對(duì)照培養(yǎng)基狀態(tài)一致，證明此批次培養(yǎng)基能夠精確的檢測(cè)出對(duì)應(yīng)微生物狀況。2.2控制菌2.2.1內(nèi)含菌約營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)含菌約內(nèi)含菌約同時(shí)，用對(duì)應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，作為對(duì)照，2.2.22.2.3控制菌培養(yǎng)基合用性檢查培養(yǎng)基名稱促生長(zhǎng)性（與對(duì)照比較）克制性（與對(duì)照比較）金黃色平葡萄球菌批示性（與對(duì)照比較）結(jié)論菌種名稱形態(tài)大小形態(tài)大小批示反映無(wú)生長(zhǎng)------符合規(guī)定--符合規(guī)定營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基--------符合規(guī)定--------符合規(guī)定無(wú)生長(zhǎng)------符合規(guī)定--符合規(guī)定--符合規(guī)定--符合規(guī)定培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)性及批示性菌落生長(zhǎng)狀態(tài)一致，克制性均無(wú)菌落生長(zhǎng)，闡明培養(yǎng)基合用性良好。3、抑菌性：取持續(xù)生產(chǎn)的三批樣品進(jìn)行測(cè)定3.1細(xì)菌、霉菌、酵母菌3.1.1供試液的制備：稱取本品10g，加pH6.8緩沖液100ml，混勻，制成1：3.1.2實(shí)驗(yàn)組：取大腸埃希菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和枯草芽孢桿菌菌懸液各1ml，分別加上述供試液1ml，注入平皿中，立刻傾注15～20ml溫度不超出45℃溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株實(shí)驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，31.3菌液組：取上述各實(shí)驗(yàn)菌液1ml，加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株實(shí)驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。3.1.4供試品對(duì)照組：取供試液1ml，分別注入15～20ml溫度不超出45℃溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基3.1.5以供試品對(duì)照組為樣品空白(C0)、以菌液組為對(duì)照(T)、以實(shí)驗(yàn)組為測(cè)試品(C)計(jì)：(C-C0)/T≥70%細(xì)菌、霉菌及酵母菌抑菌性檢測(cè)成果統(tǒng)計(jì)批號(hào)培養(yǎng)基名稱菌種培養(yǎng)時(shí)間（h）菌液組菌數(shù)Cfu實(shí)驗(yàn)組菌數(shù)Cfu供試品對(duì)照組菌數(shù)回收率%數(shù)值平均數(shù)值平均數(shù)值平均150804營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌7284869092.581095.9728895金黃色葡萄球菌7286849391.597.072829012大腸埃希菌728485.5919295.9728793玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌1208686.584850098.31208786金黃色葡萄球菌1208787.5858698.312088870大腸埃希菌1208785.5838397.11208483150805營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌7288859592.56597.1728690金黃色葡萄球菌728584.59593.595.57284924大腸埃希菌728184.58991.597.7728794玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌12083858787.50097.11208788金黃色葡萄球菌12086848886.597.112082850大腸埃希菌1208884868895.51208090150806營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌728785.59495.56695.5728497金黃色葡萄球菌728386969695.67289966大腸埃希菌728585.5959695.0728697玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌120848485870096.61208489金黃色葡萄球菌1208585.5908996.112086880大腸埃希菌1208283.5898796.01208585通過(guò)持續(xù)三批次不同種菌類的加樣，回收率均在90%以上，闡明本產(chǎn)品對(duì)于細(xì)菌、霉菌及酵母菌不含有抑菌性。3.2控制菌3.2.1取10供試液（制備辦法同3.1.1）及1ml(10～100cfu)加入3.2.2取10供試液（制備辦法同3.1.1）1ml(10～100cfu)3.3合格原則若上述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出實(shí)驗(yàn)菌，則按此供試液制備辦法和控制菌檢查辦法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查?？刂凭志詸z查大腸埃希菌實(shí)驗(yàn)組（+/-）陰性對(duì)照組（+/-）MUG++--靛基質(zhì)++--沙門氏菌實(shí)驗(yàn)組（+/-）陰性對(duì)照組（+/-）四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基++--膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基+