堿提取-酶解法提取砂黃海中的粘多糖

氨基酸又名氨基酸多樣性，也被稱為氨基葡萄糖。它起著防洪、腫瘤、抗凝劑、降血率、抗輻射和身體免疫功能等多種作用。現(xiàn)在它已被廣泛使用到醫(yī)藥、護理等行業(yè)。20世紀80年代，中國開始研究動物來源的氨基酸粘多糖，主要集中在海洋上可食用動物，而其他動物的研究很少。砂海星屬棘皮動物門(Echinodermata)海星綱(Asteroidea),在山東沿海特別是膠東半島有大量分布,資源豐富,其酸性粘多糖的研究未見報道.本研究就砂海星的酸性粘多糖進行了初步分離純化及性質(zhì)鑒定,以期為砂海星的開發(fā)利用提供參考依據(jù).1材料和方法1.1樣品采集和粉碎實驗用材料砂海星(LuidiaquinariavonMartens)于2006年4-5月采集自山東煙臺牟平區(qū)附近海域潮下帶,標本存放于煙臺大學海洋生物學實驗室.樣品新鮮時用水沖洗凈泥沙,自然風干,用粉碎機粉碎(約40目左右),置陰涼通風處備用.1.2純或生化試劑的篩選20PR-520型冰凍離心機,SP-2000UV型紫外可見分光光度計,TH-500梯度混合器,HD-3紫外檢測儀,BSZ-100自動部分收集器,LM-17型記錄儀,DHL-A電腦恒流泵等.枯草桿菌中性蛋白酶,蒽酮,葡萄糖,DEAE-52,考馬斯亮藍G250,葡聚糖(Sephadex)G-50、G-100,藍色葡聚糖,對氨基苯磺酸,DextranT-10,DextranT-40,DextranT-70,異戊醇等.以上試劑均為分析純或生化試劑.1.3中性蛋白酶的制備稱取500g樣品,加入2000mL0.1mol/LNaOH與0.1mol/L的硼氫化鈉溶液,60℃攪拌過夜.冷卻后用三氯乙酸調(diào)pH至4.00,5000r/min離心15min;取上清液,將pH調(diào)至7.00,加入5g枯草桿菌中性蛋白酶,50℃攪拌過夜,5000r/min離心15min;取上清液,加入5%的雙氧水脫色,加入量約為樣品液體積的1/8,55℃保溫至溶液變?yōu)闇\黃色,將脫色后的溶液濃縮至合適體積,按1∶4加入95%的乙醇,5000r/min,30min,取沉淀溶于適量蒸餾水中,水浴60℃,使其充分溶解.將pH調(diào)至7.0,加入3g枯草桿菌中性蛋白酶,50℃攪拌過夜,酶解完畢后,三氯乙酸調(diào)pH至4.00,8000r/min離心20min,取上清液加入乙醇使乙醇體積分數(shù)為42%,8000r/min離心20min;取沉淀用乙醇和丙酮洗滌,攤于平皿上,50℃真空干燥,得到精制砂海星粘多糖I,上清中再次加入乙醇,使乙醇體積分數(shù)為80%,操作同上,得到精制砂海星粘多糖II.1.4蛋白質(zhì)含量和總糖含量的測定用蒽酮比色法測定總糖含量,用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定蛋白質(zhì)含量,均參照文獻的方法進行.蒽酮比色法測定總糖含量時,用葡聚糖作標準曲線.1.5硫酸基的鑒定和顏色反應分別參照文獻及的方法進行.1.6樣品的制備DEAE-52纖維素柱(2.6cm×25cm),梯度洗脫:用0-1mol/L氯化鈉溶液(以10mmol/LpH7.0的磷酸緩沖液配制),以30mL/h的速度洗脫,檢測器波長調(diào)至220nm處跟蹤記錄,上樣樣品為精制砂海星粘多糖II;將峰值管中樣品收集備用.1.7水體積測定葡聚糖SephadexG-50的預處理及裝柱:將其先用水煮沸約4h,待其冷卻至室溫,抽氣,裝柱(1.6cm×50cm),柱床上方蓋一大小合適的濾紙片,以30mL/h的流速平衡過夜.內(nèi)外水體積測定:用1mg/mL的藍色葡聚糖與0.1mg/mL對氨基苯磺酸溶液上樣,以30mL/h的速度洗脫,在波長為254nm時跟蹤記錄.上樣及洗脫:以10mL/h的速度上樣,待樣品完全進入柱床后加蓋3cm緩沖液,用15mL/h的速度洗脫,檢測器波長調(diào)至220nm處跟蹤記錄.1.8多酚氧化酶的測定參照文獻的方法進行.2結(jié)果與討論2.1砂海砂糖組的表觀特性從砂海星提取的酸性粘多糖為乳白色無定形粉末,H2O2脫色和真空干燥能有效改善砂海星多糖的色澤.2.2糖及蛋白質(zhì)含量測定實驗總糖和蛋白質(zhì)含量測定的結(jié)果見表1、2.樣品測定均設(shè)2個重復.酸性粘多糖提取要解決的主要難題為:在多糖不被顯著降解的情況下除去結(jié)合蛋白.此過程中,不僅要破壞多糖聚集體間的次級鍵,更主要的是要破壞糖鏈與蛋白質(zhì)間的糖肽鍵,從而釋放出多糖.本實驗采用堿提法和酶解法相結(jié)合以及二次酶解,可以提取到純度較高的酸性粘多糖,二次酶解后精制酸性粘多糖中的總糖含量分別為71.6%和80.4%,蛋白質(zhì)含量分別為1.52%和1.38%(一次酶解后,粘多糖的蛋白質(zhì)平均含量約為10%),二次酶解可顯著減少粘多糖中的蛋白質(zhì)含量.每次進行的糖及蛋白質(zhì)含量測定實驗,均平行做了3個樣品,重復性好,數(shù)據(jù)均為平均值.2.3莫氏試劑中沉淀的檢測硫酸基的鑒定表明樣品液中含有硫酸根:在糖的鹽酸裂解液中加入BaCl2溶液,則變混濁,靜置片刻,有白色沉淀出現(xiàn).將沉淀取出加入到稀硝酸中,沉淀不溶解,證明沉淀為硫酸鋇而不是碳酸鋇,由此可知樣品液中含有硫酸根.將莫氏試劑與樣品裂解液混合后,在硫酸和水的液面交界處有紅褐色環(huán)帶出現(xiàn),試管中液體呈現(xiàn)淺綠色;將塞氏試劑與樣品裂解液混合并置于沸水浴中,樣品液為淺黃色.結(jié)果表明樣品含醛糖,不含酮糖.2.4考察配方的作用如圖1所示,DEAE-52纖維素柱純化洗脫曲線只有一個明顯的峰,說明樣品中組分在該條件下大多數(shù)分子所帶電荷數(shù)量較為均一(但不能確定是否為同一種物質(zhì),有待于進一步研究).2.5柱洗脫體積和峰洗脫體積分子篩SephadexG-50柱的內(nèi)水體積為31.2mL,柱外水體積為70.8mL,柱總體積102mL.樣品峰洗脫體積為91.0mL.將經(jīng)離子交換得到的樣品用SephadexG-50進行分離,得到一個較為明顯的峰,且洗脫體積在內(nèi)水體積(圖2).說明樣品中含有一種較為均一的主要組分.2.6分子篩表面活性劑的檢測法結(jié)果見表2.用3種分子量的標準糖混合液(DextrinT-10;DextrinT-40;DextrinT-70,每種標準糖約70mg)上SephadexG-100柱,得到3個比較明顯的峰.同樣條件下,用經(jīng)離子交換得到的酸性粘多糖樣品0.15g上柱,結(jié)果見圖3.分子篩SephadexG-100柱的內(nèi)水體積為28.0mL,外水體積為64.7mL.由圖3可以得出,待測樣品峰洗脫體積為83.3mL.由圖4得分子量標準曲線為:y=-1.0881x+5.0188,經(jīng)計算知樣品平均分子量約為12200.3砂海運粘多糖的理化性質(zhì)用堿提法結(jié)合酶解法能有效地從砂海星中提取酸性粘多糖,樣品粉末可溶性良好.雙氧水可有效將其脫色;二次酶解可有效去除結(jié)合蛋白,乙醇分級沉淀后可得到砂海星酸性粘多糖Ⅰ、Ⅱ,總糖含量可達到71.6%和80.4%,蛋白質(zhì)含量則降低為1.52%和1.38%.并對粘多糖Ⅱ進行進一步研究后,發(fā)現(xiàn)其為酸性粘多糖,含有硫酸根,