益生菌的定義與應(yīng)用

自20世紀50年代使用抗生素以來，由于其有害藥物的耐藥性、動物體內(nèi)菌群的異質(zhì)結(jié)和抗生素本身的殘留，抗生素已成為世界各國的主要污染物，并產(chǎn)生了巨大的負面效應(yīng)，這也是抗生素治療世界農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要因素。在這種情況下,益生素(probiotics)的研究和應(yīng)用就引起了人們越來越多的關(guān)注。隨著微生物學(xué)和微生態(tài)學(xué)的深入研究,利用益生菌來調(diào)節(jié)動物體內(nèi)的微生態(tài)平衡,恢復(fù)機體正常生理功能、防治病害、增進健康,正逐漸成為世界范圍內(nèi)的熱潮。由于益生菌制品沒有殘留,也不會產(chǎn)生抗藥性,許多國家的飼料和畜禽業(yè)生產(chǎn)者在政府管理部門限制和禁止使用抗生素的同時,也開始主張用益生菌制品來代替飼料中的抗生素。1益生菌的定義益生菌(probiotics),是微生態(tài)制劑的一個類別,在國內(nèi)又譯成益生素、益生劑、生菌素、促生素、生菌劑、益菌劑等。Probiotics一詞源于希臘文,是“共生”的意思,與Antibiotics相對立,意味著“在動物之間的生命維持上起到相互補益的作用”。而它的現(xiàn)代定義則最早在1965年被Lilly和Stillwell闡述為“由一種微生物分泌刺激另一種微生物生長的物質(zhì)。”此后,隨著對益生菌研究的深入,益生菌的定義也屢次被修訂。Parker在1974年將其表述為“能促進腸道平衡的有機生命及其相關(guān)物質(zhì)。”隨后,Fuller在1989年又提出益生菌是“添加于飼料中,通過改善動物腸道微生物平衡而對其發(fā)揮有利影響的微生物活體”。1994年,在德國Herborn召開的益生菌研討會上,與會者又定義益生菌為“益生菌是含活菌和(或)死菌包括組份和產(chǎn)物的微生物制劑,供口服或者經(jīng)由其他粘膜途徑投入,旨在粘膜表面處改善微生物和酶的平衡,或刺激特異性和非特異性免疫機制”。1997年,Tannock又提出益生菌的新定義“作為飼料添加劑以促進動物健康的活體微生物”。此外,在國內(nèi),一些學(xué)者也從不同角度對益生菌作了修訂和定義。2長壽研究的理論基礎(chǔ)2.1動物微生態(tài)學(xué)微生態(tài)學(xué)即微觀生態(tài)學(xué),是“研究正常微生物群與其宿主間相互關(guān)系的生命科學(xué)分支”。而動物微生態(tài)學(xué)則是“研究動物體內(nèi)微觀環(huán)境中的正常微生物及其宿主相互關(guān)系的微生態(tài)學(xué)分支”。一般認為,動物微生態(tài)學(xué)包括4個方面的內(nèi)容,即動物微生態(tài)平衡理論、動物微生態(tài)失調(diào)理論、動物微生態(tài)營養(yǎng)和動物微生態(tài)防治理論。動物微生態(tài)理論認為,動物及體內(nèi)寄生的微生物相互作用,相互影響;在環(huán)境因素的影響下,動物與微生物保持動態(tài)的平衡;在動物與環(huán)境的關(guān)系中,正常微生物群中的原籍菌對動物有益,外籍菌則有害,兩者又可相互轉(zhuǎn)化;正常微生物群的組成存在種屬和個體的特異性;特定的環(huán)境條件可造成動物微生態(tài)失調(diào),使生態(tài)系統(tǒng)喪失功能;動物與微生物群之間存在共生關(guān)系,互相提供營養(yǎng)等生存條件等。這些理論是當(dāng)前益生菌研究的理論基礎(chǔ)。2.2益生菌的作用機理益生菌被攝入動物體腸道后,在復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境中與近400種正常菌群匯合,顯現(xiàn)出棲生、偏生、競爭或吞噬等復(fù)雜的關(guān)系,改變生物體內(nèi)的微生物群落,促進宿主動物的健康。但是,與抗生素相比,益生菌的作用機理在理論上進展還很小,目前主要有3種學(xué)說:①優(yōu)勢種群學(xué)說;②菌群屏障學(xué)說;③微生物奪氧學(xué)說。3益生菌的產(chǎn)生由于逐漸認識到抗生素作為飼料添加劑的種種弊端,因此,世界衛(wèi)生組織(WTO)、聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)以及美、日、歐洲各國均極為重視益生菌的研制,在理論和應(yīng)用方面都進行了深入細致的研究,取得了豐碩的成果。目前,益生菌已在很多國家進入商品化生產(chǎn)。在我國,益生菌研究也得到了蓬勃發(fā)展。但是,國內(nèi)外目前的益生菌研究,大部分都集中在畜禽業(yè)方面,有相當(dāng)多的資料文獻對畜禽的益生菌作了深入的報告。而與畜禽業(yè)相比,水產(chǎn)動物益生菌的研究就少得多,無論是在數(shù)量還是在研究層次上都與畜禽業(yè)方面的益生菌研究有較大的差距,并且,其真正意義上的商業(yè)產(chǎn)品的實踐應(yīng)用也只是1986年的事。因此,可以說,水產(chǎn)動物益生菌的研究尚處于起步階段。4基于水產(chǎn)動物的共生基礎(chǔ)研究4.1腸道菌群的變化很顯然,水產(chǎn)動物與陸生動物的最大不同就在于生活環(huán)境的巨大差異,由此也造成了水產(chǎn)動物益生菌與陸生動物益生菌的較大差異。不像大多數(shù)陸生動物在胚胎階段有羊膜保護,大多數(shù)魚蝦貝類的幼苗孵化后便直接暴露于水環(huán)境中,立即與水環(huán)境中的微生物發(fā)生關(guān)系,并且在它們的成長過程中,消化管一直與外界直接相通,沒有一個穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境,并遭受著水的沖刷與外界微生物群的直接侵襲,因此,水生動物消化道內(nèi)的菌群的更替和定植,與陸生動物是很不相同的。另外,水生動物體內(nèi)的益生菌群組成與陸生動物益生菌組成也不盡相同。在陸生動物的消化道中,往往有占優(yōu)勢的革蘭陽性菌存在,而在魚類貝類消化道中,則往往能發(fā)現(xiàn)大量的革蘭陰性菌。而且,即使是同一菌群,在水生動物和陸生動物之間也不盡相同。Smith在20世紀30年代指出,魚類具有與一般大腸埃希菌不同的魚類大腸埃希菌,具有液化明膠和不產(chǎn)生吲哚的特性。所以,與陸生動物相比,水生動物益生菌群在組成、變化甚至選擇難度上都有著自身的特點,這也是水生動物益生菌研究滯后于陸生動物益生菌研究的重要原因。4.2菌的特性特性雖然水生動物益生菌在很大程度上與陸生動物的益生菌有差異,但是作為益生菌,它們也有一些共同的特征,這些特征是益生菌共有的特征,也是在研究實踐中鑒定益生菌的很好標(biāo)準(zhǔn)。Fuller在1989年提出,益生菌應(yīng)該具有以下特征:①能為宿主動物帶來有益的影響,如促進生長、抵抗病害等;②應(yīng)當(dāng)是無毒無害的;③在我們不知道其確切作用劑量的條件下,必須在宿主體內(nèi)保持有活力的大量活體;④能在低pH值及有機酸存在等惡劣的腸道環(huán)境中存在并正常生活;⑤能在儲存保藏條件下較長時間地保持穩(wěn)定并維持活力。國內(nèi)田允波等也提出了作為飼用益生菌的菌種所應(yīng)具有的特征:①無病原性、無毒性、無毒副作用、不與病原微生物產(chǎn)生雜交種;②體內(nèi)外繁殖速度快,具有很強的競爭優(yōu)勢;③能在低pH值的無機酸、有機酸及膽酸存在的情況下存活并定植在胃腸道內(nèi);④能產(chǎn)生乳酸、過氧化氫等腸道致病菌的抑制物;⑤加工后存活率高,混入飼料后室溫下穩(wěn)定性好;⑥能促進動物的生長發(fā)育。4.3水產(chǎn)動物益生菌要弄清益生菌的組成是件很不容易的事。在研究較為深入的人類菌群方面,Moore和Holdemann認為大概有400種正常腸道微生物。在Fuller的綜述中提到畜禽中常見的益生菌有L.bulgaricus,L.acidophilus,L.casei,L.helveticus,L.lactis,L.salivarius,L.plantarum,Streptococcusthermophilus,Enterococcusfaecium,Ent.faecalis,Bifidobacteriumspp.和E.coli。已確認的適合用于生產(chǎn)的益生菌的菌種較少,主要是乳酸桿菌、糞鏈球菌、芽胞桿菌、雙歧桿菌、仙人山屬菌、優(yōu)桿菌以及酵母菌等。而在水產(chǎn)動物益生菌的研究中,由于水環(huán)境的復(fù)雜性以及水產(chǎn)動物菌群的相對不穩(wěn)定性等原因,對于水產(chǎn)動物益生菌組成的報道也較為缺乏。Bruno等指出,當(dāng)前水產(chǎn)研究中主要使用的益生菌有弧菌、假單胞桿菌、芽胞桿菌和一些乳酸菌。據(jù)薛恒平等所引杉田治男對羅非魚的腸道菌群的研究表明,弧菌和氣單胞菌是羅非魚腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌,占70%以上,其他還有棒狀桿菌、酵母菌等。薛恒平等同時還引用Kimiaki對對蝦腸道菌群的演替的研究。Kimiaki發(fā)現(xiàn)在對蝦蚤狀幼年期時,水中的優(yōu)勢菌(弧菌)同樣也是蝦腸道中的優(yōu)勢菌。王紅寧報道鯉魚腸道中需氧、兼性厭氧優(yōu)勢菌是氣單胞菌和醇母菌,而厭氧優(yōu)勢菌是擬桿菌,它們與乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸埃希菌、梭狀芽胞桿菌、假單胞菌一起構(gòu)成腸道內(nèi)正常的菌群。另外,對于研究最為深入的水產(chǎn)動物益生菌之一的乳酸菌,在挪威學(xué)者RingΦ和法國學(xué)者Gtesoupe的相關(guān)綜述中對其作了精細的分類。除此之外,Gatesoupe在1999年的文章中也總結(jié)中了迄今為止大部分已做過抗菌實驗并得到鑒定的水產(chǎn)動物益生菌種。但是,由于水產(chǎn)動物益生菌群的復(fù)雜性,因此確切的水產(chǎn)動物益生菌譜,至今還無人報道。4.4益生菌的市場眾多的研究表明,水產(chǎn)動物體內(nèi)的菌群主要是由魚吞咽水與進食時所帶入,進入體內(nèi)的各種菌種相互作用競爭,最后達到生態(tài)平衡,從而形成水產(chǎn)動物體內(nèi)的正常菌群,起到保護作用。這種作用可以用圖1表示。Gatesoupe的研究表明,細菌可以通過水產(chǎn)動物的口腔進入體內(nèi),甚至在消化管尚未完全發(fā)育成熟時,第一次攝食活體生物,就可以使Vibrol/Aeromonas菌群在體內(nèi)迅速占據(jù)優(yōu)勢。田允波等在關(guān)于益生菌的綜述中提到,菌群在腸道內(nèi)定植是通過細菌的粘附作用來實現(xiàn)的,乳酸桿菌、雙歧桿菌等進入腸道能否粘附于宿主某段腸道粘膜上皮細胞表面,形成穩(wěn)定的優(yōu)勢菌群,是決定這種益生菌實際效果的重要問題,而且,益生菌對宿主的粘附作用還有種屬特異性,細菌的屬種株不同,其粘附性也有差異。實際上,菌群在水產(chǎn)動物中的定植,從水產(chǎn)動物的卵期就已開始。Hansen和Olafsen發(fā)現(xiàn),在大西洋鱈與擬庸鰈的卵受精后2小時,在卵上已發(fā)現(xiàn)有相當(dāng)數(shù)量的菌群,其中一部分菌群也是以后動物腸道內(nèi)的有益菌群,并且也發(fā)現(xiàn),某些菌群對于魚卵的附著存在特異性。Hnansen在1999年的研究中也得出了同樣的結(jié)論。另外,也有研究報道稱,在孵化4天的大西洋鱈幼魚和狼魚魚苗中發(fā)現(xiàn)已有乳酸菌和C.devergens等益生菌群存在。目前,對益生菌在水產(chǎn)動物體內(nèi)定植問題的研究,一般分為活體實驗和體外研究,這兩方面互相印證,就可以得到較為可信的結(jié)論。Jo¨bornJo¨born等在1997年對大馬哈魚的無毒菌株Carnobacteriumsp分別作了活體和體外的定植實驗,結(jié)果顯示該菌株在體內(nèi)有穩(wěn)定的定植數(shù)天,在體外則也能成功地在腸粘膜與排瀉物中定植。Vazquez-Juarez等的實驗證明酵母能在虹鱒的腸道粘膜處成功定植。另外,Hansen還研究了正常成熟的益生菌群在海洋冷水性魚類消化道中建立所需的時間,他的研究表明,一個成熟的益生菌群的建立,在第一次進食后,要經(jīng)過幾次更替,需要花費數(shù)周到數(shù)月的時間才能完成。Gatesoupe在其1999年的綜述中還詳細列出了在人工控制下各種益生菌在體內(nèi)的最短停留時間,這是很有價值的資料(見表1)。除此之外,RingΦ和Gatesoupe他們1998年關(guān)于乳酸菌的綜述中也總結(jié)了關(guān)于益生菌在水生動物體內(nèi)定植部位的研究。相關(guān)研究表明,在魚類整個消化管,包括從食管到大腸,都有益生菌的存在。但是由于胃中的低pH值環(huán)境、幽門部膽汁環(huán)境等不適于大多數(shù)益生菌生存,所以在這些部位定植的益生菌很少,而絕大部分益生菌都定植于腸道之中,并且真正起作用的益生菌,大部分也是腸道益生菌群。因此,水生動物腸道菌群的情況,可以反映整個動物體內(nèi)微生態(tài)平衡的情況。4.5影響因素4.5.1生活在魚體內(nèi)的克氏原螯蝦及腸道菌群有很多因素會影響水產(chǎn)動物體內(nèi)益生菌群的組成、定植與更替。食物無疑是其中一個很重要的影響因素。不同種類的食物,甚至食物中不同水平的營養(yǎng)素組成,都對體內(nèi)正常益生菌群產(chǎn)生影響。Syvokienё和Mickёnienё在1995年對波羅的海沿岸10種海洋魚類的消化道微生物群作了全年的調(diào)查,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在食性不同的魚類之間,其腸道微生物群存在很大差異,而在同一種魚中,不同季節(jié)的腸道微生物群也有很大差異。在夏季,異養(yǎng)型細菌數(shù)量明顯增多,研究者認為,這與夏季有機生物豐富,魚所進食物有關(guān)。比利時和中國學(xué)者在1995年到1996年對中國北部的蝦苗調(diào)查也得出了類似的結(jié)論。其他研究也表明,腸道菌群組成因魚的食性不同而不同,動物性食性魚類主要優(yōu)勢菌群為腸微球菌、貝內(nèi)克菌群和弧菌,其次是假單胞菌、氣單胞菌,而植物性食性的魚類還有較多的嗜酸性桿菌和雙歧桿菌。Gatesoupe的研究也表明,當(dāng)把給幼苗的餌料由活性餌料改為配合飼料時,其腸道內(nèi)的細菌數(shù)量會發(fā)生大幅度的下降,但原來的優(yōu)勢菌群卻仍占據(jù)著主要的份額。另外,飼料中某些營養(yǎng)素對水產(chǎn)動物腸道菌群也有一定的影響,在這方面,高不飽和脂肪酸(PUFA)對腸道菌群的影響頗為引人注目。早在20世紀50年代初期,有學(xué)者指出,少量的PUFA可以促進某些微生物的生長,但到了80年代初,又有學(xué)者提出食物中的長鏈脂肪酸,特別是不飽和脂肪酸,對于很多細菌而言是有毒性的。RingΦ于1993年首次研究了亞油酸對于大西洋紅點鮭腸道微生物群的影響,當(dāng)在飼料中添加2.5%的亞油酸后,腸道中沒有檢測到乳酸菌,相反卻觀察到大量的Aermonasspp.Pseudomonasspp.和Enterobacteriaceae。RingΦ認為,是飼料中的亞油酸,導(dǎo)致了腸道內(nèi)乳酸菌的衰退。但是,RingΦ在1997年再次進行相似的實驗,卻得出了相反的結(jié)論。隨后的一些實驗也表明,食物中不同的PUFA含量,確定能引起動物腸道菌落的變動。雖然機制仍不明了,但是研究者認為,這有可能與食物中PUFA水平改變腸道內(nèi)壁脂肪酸組成有關(guān)。4.5.2溫度和鹽度對水生動物腸道菌群的影響毫無疑問,環(huán)境因素,對于水產(chǎn)動物腸道菌群的影響是明顯的。環(huán)境因子包括溫度、鹽度,以及其他生物的影響等等。Kvasnikov等報道,在塘養(yǎng)魚類中的乳酸菌密度有隨著季節(jié)變化而變化的特性,其密度最高值是在夏季中期。這表明,氣溫對于水生動物腸道菌群有一定的影響。另外,水的鹽度同樣對水生動物腸道菌群產(chǎn)生影響。有報道指出,當(dāng)魚從淡水遷移到海水中時,其腸道菌群會發(fā)生更替,其中最顯著的是Aeromonas菌群的優(yōu)勢地位被Vibrio所代替。除此之外,Bergh等在研究初次進食對于擬庸鰈腸道菌群更替的影響時發(fā)現(xiàn),初次進食后,魚腸道菌群會發(fā)生一定的更替,而且,這些更替在環(huán)境中存在浮游植物群落時進行的更快。這說明,水環(huán)境中其他生物,尤其是小型生物的存在,對水生動物體內(nèi)菌群會產(chǎn)生一定影響。4.5.3腸道菌群的穩(wěn)定性當(dāng)水產(chǎn)動物遭受到外界對其產(chǎn)生的不利影響時,比如,食物匱乏、環(huán)境惡化、機械搬運等,即遭受脅迫時,其體內(nèi)的正常菌群同樣會受到干擾和影響。有報道稱,當(dāng)食物中某些必需營養(yǎng)素缺乏或供給不足時,會在腸道菌群內(nèi)產(chǎn)生對該營養(yǎng)素的爭奪而導(dǎo)致菌群組成的失調(diào)。也有研究指出,當(dāng)水溫驟變,水環(huán)境惡化,魚放養(yǎng)密度過大的情況下,水生動物體內(nèi)的微生物群落的微生態(tài)平衡便會被破壞,由多樣性的微群落結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣谀承┚荷L繁殖而失去微生態(tài)平衡,多種魚病則可能隨時發(fā)生。而且,在這種情況下,腸內(nèi)氣單胞桿菌及假單胞菌屬中的一些種類往往會轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡Ｖ劣谒a(chǎn)動物常遇到的搬運、人為擾動等外界脅迫因子,也應(yīng)該會對其微生態(tài)平衡有很大影響,但是很遺憾,目前幾乎沒有這方面的報道。4.5.4對水生動物體內(nèi)菌群的影響在水生動物體內(nèi)菌群的研究中,人們發(fā)現(xiàn),某些特殊的物質(zhì)會對動物體內(nèi)的正常菌群產(chǎn)生意想不到的影響。目前,人們已發(fā)現(xiàn)的這種特殊物質(zhì)主要有鉻、鐵,以及一些特殊的生化物質(zhì)。其中,對鉻和鐵的研究是人們目前較為感興趣的。作為常用于測定水產(chǎn)動物消化率指標(biāo)物的氧化鉻(Cr2O3),其對動物體內(nèi)菌群的影響是近年來才被發(fā)現(xiàn)的。RingΦ在這方面作了大量的工作,他的綜述中指出,在飼料中添加鉻,可以導(dǎo)致腸道與糞便中革蘭陰性菌群的衰落與膽汁牛磺酸水解酶活性的增加。雖然這種情況目前尚未得到很好的解釋,但是RingΦ提出了兩點假說:①氧化鉻影響消化道壁的吸附性;②需氧菌對氧化鉻具有高度敏感性。至于鐵對水生動物體內(nèi)菌群的影響,也已有一些研究認為,在飼料中限制鐵的含量,會降低體內(nèi)菌群的數(shù)量。Gatesoupe等研究報道,當(dāng)用添加了除去鐵鹽的無機鹽復(fù)合物的飼料飼喂尖吻鱸幼魚時,其體內(nèi)的細菌數(shù)從109CFU(集落生成單位)/克體重下降為3×108CFU/克體重,可見,鐵是水生動物維持正常菌群的一個重要因子。另外,有研究認為,影響動物腸壁生化組成的糖蛋白、糖脂等也能影響菌群在體內(nèi)的定植與更替。4.6關(guān)于長壽機制的研究4.6.1益生菌細菌素的組成很多在活體與體外條件下所進行的實驗證實了益生菌良好的作用效果,但是,就如在本文開頭提到的,目前對于益生菌作用機理的基礎(chǔ)研究還不是很多,在不少問題上也存在著不一致的看法,但是,綜合目前已有的資料來看,主要集中在幾個方面。其中,益生菌分泌物的研究是一個很熱門的研究方向。很多研究表明,大部分益生菌能夠分泌某些物質(zhì),以抑制或殺死周圍其他異種有害菌群,人們把這些物質(zhì)統(tǒng)稱為細菌素(bacterocin)。目前,對細菌素組份的學(xué)說甚多,一般認為,他可以是益生菌為與其他菌種競爭而釋放的抑菌物質(zhì),也可能是其本身的代謝物質(zhì),抑或二者兼而有之。RingΦ和Gatesoupe認為,細菌素是一種特異性的復(fù)合物,乳酸菌細菌素的有效成份是過氧化氫、有機酸以及它們所分泌的乳酸。這與Lewus等的結(jié)論相似,也與陸上動物益生菌細菌素的研究結(jié)論相仿。但是,其他研究也表明,細菌素并不都是這些物質(zhì),除此之外還有生物表面活性劑(biosurfactant)、羊毛硫抗生素(lantibiotics)、鐵載體(siderophores),甚至各種短肽,如乳酸鏈球菌肽(Nisin)、肽聚糖(peptidoglycan)等。4.6.2降低病害菌的數(shù)量和密度競爭抑制是益生菌的重要作用機制,也是微生態(tài)理論的主要觀點。在水產(chǎn)動物體內(nèi),益生菌對病害菌的競爭性抑制,大致可分為占位抑制與營養(yǎng)抑制。在益生菌所有的生物效應(yīng)中,與病害競爭附著點,可能是益生菌進入體內(nèi)后發(fā)揮的第一個作用。通過對體內(nèi)固定位點的競爭,使益生菌自身在體內(nèi)占到優(yōu)勢,降低病害菌的數(shù)量和密度,起到防病害的作用。在陸生動物中的大量研究證明,某些益生菌能夠阻止一些病害菌的定植。在水產(chǎn)動物中,對益害菌雙方定植速度的研究尚不多見,多是結(jié)合分泌物質(zhì)的抑菌作用來探討這個問題。有研究表明,益生菌分泌物功能之一是抑制病害菌的固著能力,從而使自身在競爭固著位點時處于有利地位。然而,競爭,不僅僅病害菌數(shù)量的減少,在某些情況下,會出現(xiàn)“自我抑制”(atroinhibition),即在益生菌的有益作用得到保證的前提下,在競爭中益生菌本身數(shù)量下降的速度反而要高于病害菌。Gibson等在1998年關(guān)于牡蠣幼體抗病的研究報告中證實了這一點。但確切機理,目前仍不清楚。當(dāng)飼料中營養(yǎng)素產(chǎn)生缺乏時,益害菌之間競爭有限營養(yǎng)素的利用便也成為相互抑制的重要方面,益生菌通過更有效地利用有限的營養(yǎng)素而導(dǎo)致病原菌營養(yǎng)缺乏,并以此使自身在競爭中取得勝利,但是遺憾的是,這方面的研究報道相當(dāng)缺乏。4.6.3益生菌與益生菌群益生菌的作用機制除了直接的抑菌作用之外,還有其他的作用,那就是對遠離消化道的免疫系統(tǒng)的影響。這是益生菌作用機制中一個頗令人感興趣的領(lǐng)域,因為它提示著益生菌與抗生素的重大差異,并成為替代抗生素的一個重要理由。在陸生動物中所進行的一系列實驗表明,動物體內(nèi)的益生菌群的存在可以增強動物自身的免疫力,其免疫指標(biāo)如巨噬細胞、免疫球蛋白、抗體等都與益生菌群有著密切的相關(guān)性。但與陸生動物相比,水產(chǎn)動物這方面的研究則幾乎是一片空白,僅有很少量的文獻報道了水產(chǎn)動物益生菌與其免疫力的關(guān)系。最近,Rengpipat等對加喂了益生菌株BacillusS11的黑虎蝦的研究表明,益生菌的加喂,明顯提高了蝦的吞噬細胞的水平,也提高了酚氧化酶與抗菌物質(zhì)的活性,這使得實驗蝦在遭受病原菌的侵襲時,存活率大大高于對照組的蝦(54.3%:35.5%,P<0.05)。Rengpipat等人認為,益生菌除了通過與腸道病原菌進行競爭這一途徑之外,也通過體液和激素的水平增強機體免疫力來起到抗病防病的作用。但是,雖然已有研究報道了益生菌的促免疫作用,然而,應(yīng)當(dāng)承認的是,這仍是一個備受爭議的領(lǐng)域。4.6.4飼料中糖含量對益生菌抑菌效果的影響除了以上這幾方面的機制之外,也有一些研究者的研究指出了益生菌可能存在的其他作用機制。Gatesoupe在其最近的綜述中討論了鐵在益生菌抗病害作用中的地位,Gatesoupe綜合了近幾年來該方面的研究認為,鐵,在益生菌發(fā)揮作用中,是起著一定的輔助功能的。益生菌的抑菌效果,某種程度上受到著鐵載體(siderophore)的調(diào)節(jié)。因此,飼料中鐵的含量可能會影響到益生菌作用的發(fā)揮。Gram等的研究也得出了類似的結(jié)論。另外,Santos等在體外對乳酸菌作用的機理所進行的研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌抗菌的唯一機理是它產(chǎn)酸后所造成的低pH值環(huán)境使病原菌滅亡,但并未觀察到乳酸菌過氧化氫以及蛋白水解酶發(fā)揮作用,也未觀察到其與病原菌的營養(yǎng)爭奪作用。4.6.5益生菌的營養(yǎng)作用就本文所著重論述的范圍而言,益生菌的營養(yǎng)作用與定義中所強調(diào)的益生菌生態(tài)方面的意義有一定差異,因為益生菌的營養(yǎng)作用并不需要限定菌體的活力程度。但是,益生菌的營養(yǎng)作用確實存在,而且能在生產(chǎn)上產(chǎn)生一定的效果,因此,在談?wù)撘嫔娴淖饔脵C理,有必要附帶提及益生菌的營養(yǎng)作用。水產(chǎn)動物體內(nèi)的益生菌除了本身可以幫助動物對食物進行消化,提高飼料的利用效率之外,其本身也往往含有某些營養(yǎng)物質(zhì),如酵母菌、光合細菌等含有豐富的菌體蛋白和多種維生素等微量營養(yǎng)物質(zhì),可以供給動物生長需要。雖然益生菌的作用更多在于其對體內(nèi)微生態(tài)的調(diào)節(jié),并改善宿主動物的健康狀況,但是,它的營養(yǎng)作用,也是值得注意的。4.7分離菌種在水產(chǎn)動物益生菌篩選中的應(yīng)用在益生菌的研究中,對于益生菌的鑒別和篩選,一直是個制約研究進行的重要因素。雖然對于益生菌的評判標(biāo)準(zhǔn)已有公論,但是,在實際操作中,進行該項工作實為不易。目前,對于益生菌的鑒定,往往通過采集大量不同菌株,然后在體外進行選擇性培養(yǎng)或進行抗菌實驗。在這種情況下,研究優(yōu)良的選擇性培養(yǎng)基就顯得格外重要,該方面的研究早已開展,并在Gatesoupe的綜述中作了總結(jié)。RingΦ和Gatesoupe在他們關(guān)于乳酸菌的綜述中,也詳細列出了乳酸菌選擇性培養(yǎng)基的種種原則與方法。Sugita等從7種近海魚類腸道中分離出1055種菌株進行與Vibriovalnificus菌株的抗菌實驗,從中選擇出優(yōu)良的益生菌株芽胞桿菌NM12。Riquelme等、Westeroahl等分別在不同的水產(chǎn)動物中也進行了相似的實驗。最近幾年來,由于分子生物學(xué)和各種新技術(shù)方法的興起,在水產(chǎn)動物益生菌的鑒別與篩選研究中,也出現(xiàn)了各種新的技術(shù)方法和手段。Vandenbrghe等對中國對蝦養(yǎng)殖中常見的Vibroharveyi菌株進行了全序列的ARLP指紋圖譜分析以獲取確切的遺傳特征。Spanggaurd等同時采用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)篩選法與16SrRNA測序法對虹鱒腸道菌群進行鑒別,結(jié)果證明兩種方法所得結(jié)果有相當(dāng)?shù)囊恢滦浴allner等和Gugenholtz等都在各自的相關(guān)研究報告中對分子生物學(xué)在這方面的研究應(yīng)用有詳細闡述。另外,Berton等建立了以檢測菌株脂肪酸組成為基礎(chǔ)的自動鑒定系統(tǒng),以便更快、更精確地對目標(biāo)菌群進行篩選與鑒定,而相關(guān)的數(shù)據(jù)庫和信息網(wǎng)也正在構(gòu)建之中。4.8寡糖和蔗糖對紅海蝦腸道微生物的影響益生元(prebiotics),是一種能夠促進益生菌生長繁殖的物質(zhì)。Gibson和Roberfroid定義其為“一種通過有選擇性的促進宿主腸道內(nèi)一定數(shù)量的菌群的生長,提高其活力而達到增進宿主健康的不可消化的食物成份”。目前,在這方面研究最多的是各種寡聚糖(oligosaocharides),如乳果糖、蔗糖寡糖、棉子寡糖等等。有文獻報道,寡糖的主要生理作用有:①作為動物腸道微生物增殖因子;②吸附腸道病原菌,阻斷病原菌在腸道內(nèi)的定植;③作為免疫刺激輔助因子。其中前兩項作用是主要作用。在陸生動物中,寡糖作用已得到充分肯定,并有大量研究報道。在水產(chǎn)動物方面,這方面的報道就少得多,Kihara關(guān)于乳蔗糖對于紅海鯛腸道微生物的影響作了報道。初步的研究表明,寡糖類物質(zhì)對于魚類等水產(chǎn)動物而言,同樣具有扶植益生菌、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡的作用。5水生動物和山羊的應(yīng)用研究5.1益生菌在魚類養(yǎng)殖保鮮中的作用與水產(chǎn)動物益生菌的基礎(chǔ)研究相比,對益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗中的實際效果的研究報告就相對較多了。有大量的研究報道闡述了各種益生菌在各種不同的水產(chǎn)動物養(yǎng)殖中的作用效果。其作效果大致可分為以下幾方面:①抗病害。已有相當(dāng)多的報道證明益生菌在魚蝦貝類中可以起到抗病害的作用,提高動物在遭受病害侵襲時的存活率。Gatesoupe在相關(guān)綜述中也列出了已證實能夠促進宿主動物抗病害能力的益生菌的目錄(見表2)。②促生長。也有很多研究表明,在飼料中添加合適的益生菌,可以達到促進魚蝦貝類的生長的作用。③提高飼料效率和營養(yǎng)價值,有一些對于魚類與輪蟲的研究表明,飼喂益生菌可以提高魚的飼料效率與輪蟲的營養(yǎng)價值。但是,也有極少的研究者對益生菌的添加效果提出的質(zhì)疑。Gildberg等的研究顯示,在飼料中添加乳酸菌,對于大西洋大馬哈魚魚苗的生長與存活率并沒有表現(xiàn)出預(yù)期的效果。5.2益生菌與其它飼成分的協(xié)同作用作為一種活體飼料添加劑,益生菌在實際使用中的使用條件與飼喂方式跟最后發(fā)揮的效果是有著很密切的關(guān)系的。在這方面,不少學(xué)者作了多方面多種方式的研究,以確定益生菌在實際應(yīng)用中能發(fā)揮最好的效果。在益生菌的飼喂方式上,Skjermo和Vadstein認為在海水幼魚的養(yǎng)殖中,別人需將益生菌直接投入水中,經(jīng)由益生菌—輪蟲—幼魚的食物鏈即可達到預(yù)期效果。Rentpipat等實驗了三種益生菌飼喂方式(新鮮活體、正常鹽度的益生菌液以及冷凍干燥的益生菌粉)的投喂效果,結(jié)果表明,在不同狀態(tài)的益生菌制品之間差異無顯著性。一些研究者也研究了益生菌與其它飼喂成分的協(xié)同作用。Douillet研究比較了飼喂單種益生菌和多種益生菌對于輪蟲的作用效果后認為,在輪蟲體內(nèi)真正起