dhea法與雌激素聯合hcg法建立的多囊卵巢綜合征大鼠模型

多囊卵巢綜合征（pco綜合征）是發育期婦女常見的繁殖疾病。其特點是卵巢強度障礙、高雄激素血癥和多囊卵巢囊腫。通常從青春期開始發病，發病率約為6%10%。臨床癥候具有高度異質性,不同患者的病理生理特征差異較大,發病機制不清,患者主要以藥物治療為主,臨床標本獲取較困難,故對其發病機制及治療機制的人體研究存在諸多局限,尋找理想的接近人類PCOS病理特征的動物模型對深入研究PCOS的發生發展及治療有深遠意義。本研究對孕激素聯合人絨毛膜促性腺激素(hCG)法以及脫氫表雄酮(DHEA)法2種方法構建的PCOS大鼠模型進行實驗研究,以期為后續研究提供適宜的動物模型。1材料和方法1.1實驗材料1.1.1實驗動物SPF級21日齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠120只(購于廣東省醫學實驗動物中心),體重45～55g。1.1.2諾酮硅膠棒DHEA粉劑(施瑞科技);左旋18-甲基炔諾酮硅膠棒(上海達華制藥);注射用hCG(麗珠制藥);大鼠胰島素檢測酶免(ELISA)試劑盒(廣州達瑞抗體工程技術有限公司)。1.2實驗方法1.2.1模型大鼠b.孕棒的模型評價120只SD大鼠按隨機數字表分為4組:模型組I、II各44只,對照組Ⅰ、Ⅱ各16只。模型組Ⅰ大鼠于24日齡5%利多卡因局麻后,股部內側皮埋避孕棒,每只3～4mm。對照組Ⅰ不予處理;于27日齡時,模型組Ⅰ大鼠開始頸背部皮下注射hCG1.5×103U/L和0.2ml生理鹽水,對照組Ⅰ大鼠皮下注射生理鹽水0.2ml;連續用9d后停藥。模型組Ⅱ大鼠于24日齡時開始,每天頸背部皮下注射DHEA3mg/100g和0.2ml注射用油劑,對照組Ⅱ大鼠皮下注射注射用油劑0.2ml;連續注射20d后停藥。停藥后,連續陰道涂片7d,觀察陰道上皮周期性變化,初步判斷建模是否成功。1.2.2血清狀態及指標檢測①從大鼠陰道口開放日齡起,每日8:00及20:00觀察并記錄大鼠陰道口開放情況;②動情周期變化,陰道涂片并濕片觀察陰道脫落細胞形態變化;③相關指標檢測:模型組Ⅰ大鼠在42日齡、模型組Ⅱ大鼠在51日齡、對照組大鼠在陰道涂片示動情間期時,晚8:00禁食,次日晨8:00稱重。腹腔注入10%水合氯醛麻醉,腹主動脈取血5～8ml。靜置0.5h后將全血3000rpm/min離心10min得血清。血糖儀測定空腹血糖值(FPG);大鼠胰島素ELISA試劑盒測定空腹血清胰島素水平(FINS);血清雌二醇(E2)、睪酮(T)、孕酮(P)采用微粒子酶免分析法測定。按照公式計算穩態模型評估(HOMA)指數=FINS(mμ/L)×FPG(mmol)/22.5;④卵巢形態學觀察,在采血同時各組另取大鼠解剖雙側卵巢,盡量分離去除卵巢周圍脂肪組織,濾紙包裹后迅速置于電子天平稱其濕重,計算卵巢指數(OC,表示卵巢組織的單位重量);甲醛固定稱量后的卵巢,石蠟包埋切片,HE染色。1.3統計方法數值變量以均數±標準差(ˉx±s)(xˉ±s)表示,所有數據采用SPSS13.0軟件分析,組間比較采用t檢驗。2結果2.1模型組和對照組的選取模型組Ⅰ為31±3d,對照組Ⅰ為36±2d;模型組Ⅱ為27±2d,對照組Ⅱ為35±2d。模型組大鼠陰道口開放日齡均早于對照組(t=2.534,P<0.001)。2.2主2轉移間期模型組Ⅰ中38只大鼠、模型組Ⅱ中34只大鼠連續陰道涂片觀察顯示持續處于動情間期,提示無排卵。兩對照組顯示有規律的動情周期,兩模型組失去規律動情周期的大鼠的比例分別為86.4%和77.3%(P<0.05),模型組Ⅰ建模成功率高于組Ⅱ,有統計學差異。2.3對照組p>0.05模型組I體重、卵巢濕重、卵巢指數等均高于對照組(P<0.05);而模型組Ⅱ體重較對照組明顯減輕,但解剖發現其卵巢重量及卵巢指數均高于對照組(P<0.05),見表1。2.4iii血清統一血清的i、e、p、t水平比較模型組I血清P、T水平較對照組升高(P<0.05),但E2水平與對照組相差不大。模型組II血清E2、P、T水平均較對照組高(P<0.05)。兩種建模方法顯示FPG、FINS及HOMA指數均高于相應對照組,兩模型組行兩樣本t檢驗,血清E2、P水平有統計學差異(P<0.05),余指標無明顯差異,見表2。2.5關于海南島的形態2.5.1一般形狀對照組卵巢色澤紅潤,卵巢表面多個黃體;模型組卵巢表面蒼白,體積增大,卵巢表面多個擴張的透明囊泡。2.5.2黃松砂模型的成分模型組Ⅰ(圖1)光鏡下見多個擴張的囊泡,閉鎖卵泡常見,囊泡內卵母細胞或放射冠消失,顆粒細胞層數減少(2～3層),排列疏松,極少見黃體形成;模型組Ⅱ(圖2)中見多個擴張的囊泡,顆粒細胞疏松,可見黃體組織;對照組(圖3、4)大鼠卵母細胞清晰,顆粒細胞層數多(6～10層),排列緊密,有黃體形成。3妊娠合并心臟病模型構建因大鼠有較穩定的動情周期,利用其開展實驗研究經濟方便,一直是PCOS建模的首選。PCOS動物模型的建模方法眾多,如雄激素建模法、雌激素建模法、孕激素聯合hCG建模法、胰島素聯合hCG建模法、芳香化酶抑制劑建模法及近年來雄激素聯合hCG建模法等。本實驗從中選取了目前較為公認的兩種方法進行了驗證和比較。目前普遍認為下丘腦-垂體-卵巢(HPO)軸功能紊亂導致的促性腺激素(Gn)分泌異常,主要是黃體生成激素(LH)分泌增加,是PCOS發病的中間環節。LH與高雄激素血癥、胰島素抵抗等典型PCOS的病理生理變化均密切相關。早在1989年BogovichK就提出孕激素聯合hCG建模法。其機制是皮下埋植緩釋孕激素避孕劑左旋18-甲基炔諾酮抑制HPO軸,使性激素分泌呈低水平,導致不排卵。而hCG發揮類LH的作用,在卵泡早期使用致卵泡閉鎖,故孕激素聯合使用hCG可構建PCOS動物模型。大量臨床研究發現,PCOS多起病于女性的圍初潮期。青春發育前2年,腎上腺重量及腎上腺皮質厚度增加,腎上腺雄激素合成分泌增多,臨床上表現為血清DHEA和硫酸脫氫表雄酮(DHEAS)水平顯著升高,促進了伴有腎上腺源性雄激素升高的PCOS的發生。在此理論基礎上,1991年Lee等首先用DHEA成功構建了類PCOS模型,機理為:DHEA是孕烯醇酮經△5途徑轉化為雄烯二酮的中間產物,該途徑受LH的調節。通過外源性途徑提高DHEA水平造成雄烯二酮水平增高,進而睪酮及雌酮水平升高,造成PCOS高雄激素血癥,升高的雌酮水平對FSH負反饋使促卵泡素(FSH)相對不足,卵泡發育停滯,從而導致排卵障礙及卵巢多囊改變。有學者提出PCOS“青春期發育亢進學說”,假性性早熟已被確定為兒童日后發展成PCOS的危險因素之一。故以剛離乳SD大鼠作為研究對象的建模方法更符合臨床實際而受到研究者的推崇,本實驗也選取剛離乳的幼齡SD大鼠開始建模。研究結果顯示,兩種方法建立的PCOS模型與對照組相比,在青春期表現出早熟、高雄激素、胰島素抵抗及卵泡大量閉鎖卵巢多囊性改變等,基本具備了臨床PCOS患者基本的病理生理學特征。本研究顯示,孕激素聯合hCG建模法采用皮下埋植孕激素避孕棒緩慢而穩定地釋放孕激素,用生理鹽水溶解hCG皮下注射,方法簡便易于操作,建模周期較短。DHEA因其不溶于水配制成油劑,注射后短期內很難完全吸收,吸收率的差異會影響大鼠建模成功率的高低,國內外實驗各種指標存在較大差異。本實驗在實際操作中出現DHEA粉劑不易溶解,注射油劑時較困難,注射部位局部皮膚出現硬結影響藥物吸收等問題,較難操作,且相比孕激素聯合hCG建模所需時間長。孕激素聯合hCG建模組大鼠表現為明顯的肥胖,血清E2呈低水平,而DHEA建模組未出現明顯的肥胖,相反還出現了體重較對照組減輕,E2水平也高于對照組,與臨床PCOS表現不同。這些結果說明,避孕硅膠棒聯合hCG建模組大鼠的形態學和內分泌學改變都與PCOS患者極為相似,是較為理想的PCOS動物模型。本研究結果與桂文武等、朱亮等、夏燕等的結果較吻合。結合實際應用,由于所用避孕棒長期而持續地釋放孕激素抑制HPO軸,一方面模型的持續時間長,可用于做藥物療效的長