人白細胞蛋白質提取及雙向電泳分析方法的初步研究

蛋白質組是指由細胞或組織的全部相應蛋白質組成的組。這一概念是由澳大利亞學者Wilkins和Williams于1994年提出,并最早見于1995年7月的“Electrophoresis”雜志上。蛋白質組學(proteomics)是以蛋白質組為研究對象,是在蛋白質多肽譜和基因產物圖譜技術的基礎上發展而來的,是在動態水平上通過對蛋白質進行測定,來闡述環境、疾病、藥物等對細胞代謝的影響,并分析其主要作用機理,解釋基因表達的主要形式。而雙向電泳技術(Two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)是蛋白質組學研究中的關鍵技術,目前已經廣泛應用于多種正常和腫瘤組織蛋白質圖譜的建立和特異性標志物的篩選研究。白細胞(包括中性粒細胞、酸性粒細胞、堿性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞)作為機體的特異性、非特異性免疫反應以及變態反應的主要細胞,關于它的基礎和臨床方面的研究很多,但對其進行蛋白質組方面的研究工作尚未見公開報道,本研究建立了人白細胞蛋白質提取及雙向電泳的方法,為構建白細胞在不同生理或病理條件下的蛋白質表達譜或進行蛋白質表達的差異分析奠定基礎。1試劑和儀器丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、尿素、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、過硫酸銨、CHAPS、TBP、線性固相pH梯度預制膠條(pH4～7)、礦物油均購自Bio-Rad公司;DMEM購自GIBCO公司;新生小牛血清購自成都市華星生物化學制品廠;Dextron-T500購自Pharmacia公司;考馬斯亮蘭G-250、考馬斯亮蘭R-250購自sigma公司;其余試劑為國產分析純。1.2溶液配制11細胞分解溶液8M尿素,1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-lyte,-20℃保存。2樣品水化劑8M尿素,1%DTT,4%CHAPS,0.5%Bio-lyte,-20℃保存。3sds/甘油溶液6M尿素,0.375MTris(pH8.8),2%SDS,20%甘油,-20℃保存。平衡緩沖液應用液a:臨用前加2%DTT。平衡緩沖液應用液b:臨用前加2.5%碘乙酰胺。41固染料測試溶液10%冰乙酸,40%乙醇,10%甲醇。5染色溶液10%冰乙酸,40%乙醇,10%甲醇,0.25%考馬斯亮蘭R-250(W/V)。6儀器和檢測方法7%冰乙酸,5%甲醇1.2儀器主要設備包括5417R高速離心機(德國Eppendorf公司),PROTEINIEFcell,PROTEINⅡXI2-DCell,GelAirDryingSystem,1022PLUS雙向凝膠電泳系統(美國BIO-RAD公司),UV-1100紫外-可見分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)。2實驗方法2.1分離細胞ron取外周血25ml,加入等量3%Dextron,緩慢顛倒混勻,室溫靜置30min,取上層液體(內含白細胞),加適量PBS洗滌2～3次,1300轉/分離心收集細胞。2.2凍融法提取細胞蛋白在收集的白細胞中加入5倍體積的細胞裂解液,反復吹打并于-80℃反復凍融3次,12000轉/分離心60min,上清液即為白細胞蛋白裂解液,用考馬斯亮蘭G-250法測得蛋白樣品濃度,-70℃保存備用。2.3ipg膠條電泳根據所測樣品濃度取上述樣品500μg加入水化緩沖液至總體積350μl,轉移到水化槽中。取預先平衡至室溫的IPG膠條一條,膠面向下放入水化槽,表面加礦物油覆蓋,20℃水化過夜。然后將水化溶脹的IPG膠條轉移入一向等電聚焦電泳槽中按下述步驟進行電泳:0～250V,30min;1000V,1h;1000～10000V,5h;10000V,6h;500V,20min,電泳總伏時數為88367。2.42向sds-gas2.4.1含碘乙酰胺的平衡緩沖液的t電泳完畢后取出膠條膠面向上置于含DTT的平衡緩沖液中平衡15min,然后再置于含碘乙酰胺的平衡緩沖液中平衡15min,取出后吸去膠條表面多余的液體。2.4.2凝膠的二維實驗將平衡好的膠條以膠條背面緊貼玻璃板的方式放入預先制備好的SDS凝膠中,膠條下部緊貼凝膠上表面,再加入0.5%的瓊脂糖凝膠封閉空隙,加入電極緩沖液,進行二向電泳。10mA電泳15min后加大電流至20mA直至溴酚藍前沿距離玻璃板下緣0.5cm時停止電泳。2.5決定的顏色和保存取出凝膠,按文獻所述方法用考馬斯亮藍R-250染色,染色完畢后,用玻璃紙覆蓋凝膠,放入干膠儀中干膠,并照相保存結果。3結果3.1全細胞蛋白雙向電泳以pH4～7的IPG膠條為一向進行等電聚焦,以SDS作為二向進行垂直電泳,按上述步驟對白細胞裂解蛋白進行電泳,最后用考馬斯亮藍R-250染色得到的全白細胞蛋白雙向電泳圖譜,見附圖。4后基因組中白領的檢測白細胞是機體的主要免疫細胞,主要參與機體的各種特異性、非特異性免疫以及變態反應,白細胞功能異?？梢砸鸲喾N自身免疫性疾病,而白細胞的惡變可導致各種白細胞性白血病,因此長期以來人們就運用多種方法對白細胞進行研究。隨著后基因組時代的到來,可以運用蛋白質組學的研究技術來進行白細胞的研究,而首要任務就是建立一種有效的白細胞蛋白提取和雙向電泳方法。本實驗以pH4-7的IPG膠條為一向進行等電聚焦,以SDS作為二向進行垂直電泳,對白細胞裂解蛋白進行電泳,然后用考馬斯亮藍R-250染色得到較為滿意的全白細胞蛋白雙向電泳圖譜,并用PDQuest2D分析軟件和SWISSSPORT蛋白質數據庫對該圖譜進行了初步分析,具體討論如下。4.1選擇糖溶解度及影響等電聚焦的雜質在雙向電泳中樣品處理的好壞會影響到最終實驗結果的分辨率及重復性,是雙向電泳成功的關鍵步驟。樣品的處理要在盡量提高蛋白溶解度的基礎上,減少各種可能影響等電聚焦的鹽離子、核酸等雜質。因此,我們采用密度梯度離心的方法分離白細胞,并用反復凍融法使白細胞裂解,這樣就減少了其它干擾等電聚焦的因素影響。此外在提高蛋白質溶解性方面,用三正丁基膦(TBP)代替常規方法所用的DTT,可大大提高蛋白質溶解度并促進蛋白質從第一向到第二向的轉移,取得了良好的效果。4.2ipg膠條電泳傳統的一向等電聚焦是用載體兩性電解質為基礎的圓盤電泳來進行,但存在較多缺陷,包括:載體兩性電解質形成的pH梯度較窄且不連續,存在陰極漂移現象,因兩性電解質的生產批次不同而影響實驗的重復性等缺點。在本實驗中我們采用的是固定干膠條技術(IPG技術)。運用IPG技術進行一向電泳,操作簡便,并且避免了傳統的以載體兩性電解質為基礎的等電聚焦帶來的缺陷,而且IPG膠條有不同的長度和pH范圍,可以根據具體的分離要求選取不同型號的膠條。在預實驗中我們發現白細胞蛋白的pI大多在pH5～7的范圍內,因此我們選用pH4～7長17cm的IPG膠條進行一向電泳,可以提高電泳分析的分辨率。本實驗中樣品的水化采用被動水化的方式,并以250V低電壓電泳30分鐘,可以除去膠條中的鹽離子,然后逐漸升高電壓,電泳總伏時數達到60000VH以上即可達到充分聚焦的目的。4.3向sds雜志通過對不同實驗條件的篩選,本實驗采用分離膠濃度10%,Tris-甘氨酸緩沖系統,在20℃,20mA電流進行電泳取得了較好的分離效果。4.4核心細胞系統的染色電泳完畢之后,根據不同的上樣量和不同實驗所要求的分辨率,可以選用不同的染色方法進行染色,常用的染色方法有:考馬斯亮藍(coomassiebrilliantblue,CCB-250)染色,銀染法,以及SYPRORUBBY染色法。本實驗因為是對白細胞蛋白作一常規的雙向電泳分析,故采用考馬斯亮藍染色法進行染色,同樣取得了理想的染色效果。染色完畢后的凝膠,經干膠儀干膠后可長期保存。為了進行進一步的痕量蛋白的分析,在后續實驗中我們還將進行銀染法染色,以獲得更多點和分辨率更高的白細胞蛋白質雙向電泳圖譜。4.5纖維初始鑒定獲得的電泳圖譜可運用ImageMaster2D和PDQuest等軟進行分析處理,對于不同的蛋白質斑點可根據其pI和MW通過SWISSSPORT蛋白質數據庫進行初步鑒定,對感興趣的點可應用Westernblotting、質譜甚至氨基酸序列分析等方法進行進一步的鑒定。綜上所述,本實驗建立了人白細胞蛋白質的雙向電泳分析方法,并對電泳圖譜進行了初步分析。整塊膠染色效果好、本底淺,各點分離清晰,無明顯橫向或縱向拖尾,能滿足2-DE專業軟件分析的要求,為