內皮細胞生長因子對超長皮瓣存活與氧自由基的影響

血管內生長因子（vegf）是一種特定于血管內皮細胞的糖蛋白。它可以維持血管的正常狀態和完整性，改善血管的滲透性，誘導血管的生成。這一點引起了組織修復和血管再生的高度重視。國內外學者對VEGF在不同類型皮瓣存活中的具體作用和相關機制做過一些報道,本實驗制作大鼠背部超長隨意皮瓣缺血模型,皮瓣內局部注射VEGF,為帶蒂皮瓣較大創面和促進創面愈合探索新的治療途徑。1材料和方法1.1體質量與動物鑒定實驗于2004年11月—2005年11月在華北煤炭醫學院中心實驗室完成。選擇清潔級健康成年雄性SD大鼠,體質量(300±20)g,由鄭州實驗動物養殖中心提供(動物合格證號為醫動字第410117號)。自由飲水,室溫(25±2)℃分籠喂養。1.2動物模型制備、分組及模型建立干預模型:采用1%戊巴比妥液4ml/kg腹腔內注射,麻醉成功后俯臥位固定,背部剃毛。常規消毒后,以鼠背中線為皮瓣縱軸,設計以鼠骶骨下緣處為蒂,形成3cm×10cm缺血型皮瓣,皮瓣包括背部肉膜層,解剖在背部深筋膜淺面掀起,結扎重要血管,4-0絲線間斷原位縫合。所有手術均由同一術者完成。距蒂部0～4cm為皮瓣近段,4～7cm為皮瓣中段,7～10cm為皮瓣遠段。所有器械及材料均經過嚴格消毒且整個過程都在無菌條件下進行。56只動物隨機分為二組,每組28只。分別為生理鹽水對照組(NS組)和VEGF實驗組(VEGF組)。重組人血管內皮細胞生長因子(rhVEGF)由二條165個氨基酸多肽鏈組成。將VEGF溶于0.9%NaCl溶液中形成1μg/mlVEGF工作液。皮瓣形成后即刻,于術區遠蒂端3cm×4cm選擇10個對稱位點,用微量注射器經組織面向皮下注入,VEGF組每一位點給予VEGF工作液100μl,每瓣共注入VEGF1μg,NS組每一位點給予醫用生理鹽水100μl。皮瓣形成后第十二小時、二十四小時分別取6只大鼠,于距皮瓣遠端2.5cm、5.5cm和8.5cm取材測定組織MDA含量和SOD活力。于術后第四天取大鼠12只,按隨機數分為生理鹽水組和內皮細胞生長因子組,每組6只。給藥方法同上。各組分別于皮瓣形成后第四天處死,進行組織學檢查:動物麻醉后,取材固定,常規石蠟包埋切片,蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察組織學變化。皮瓣形成后第七天,①皮瓣成活率測定:動物麻醉后,用透明硫酸紙準確描繪各組皮瓣形態,壞死區域用墨汁涂黑。壞死標準:皮膚質地變硬,顏色變黑。將描繪好的透明硫酸紙用掃描儀依次掃描后,利用真彩色醫學圖像處理系統(北京航空航天大學圖像中心)對皮瓣資料進行處理和計算,求出皮瓣存活面積與總面積之比即皮瓣成活率。②皮瓣微血管密度測定:先行FⅧ-RAg免疫組化染色,步驟同增殖細胞核抗原免疫組化染色,一抗換作兔抗鼠FⅧ-RAg多克隆抗體(1:50)。對FⅧ-RAg免疫陽性血管進行微血管密度計數,凡是染成棕黃色的單個內皮細胞或內皮細胞族,均作為一個血管計數,在低倍(×100)光鏡下每張切片隨機計算5個視野微血管數目,利用計算機全自動圖像分析系統測量出相同視野下的組織面積,按血管斷面均數/鏡下視野組織面積,即可知道1cm2組織中血管斷面的密度,單位為個/cm2。1.3主要觀察指標①主要結局:組織中MDA和SOD指標的測定。②次要結局:皮瓣成活率、微血管密度的測定、組織學檢查。1.4ss軟件10.5版本所有實驗數據均用xˉ±sxˉ±s表示,以EXCEL建庫,采用SPASS軟件11.5版本進行統計分析。采用t檢驗,檢驗水準α=0.05。2結果2.1兩組含vegf組的登記比較應用分光光度計,根據TBA法測定MDA含量及黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力,并得出結果如下。術后第十二小時二組間的MDA和SOD比較差異無統計學意義。術后第二十四小時二組的結果見表1、2。在術后第二十四小時測得皮瓣遠端組織MDA含量二組間差異有統計學意義。結果:VEGF組(2.79±0.22)nmol/mgprot,較生理鹽水組(5.42±1.35)nmol/mgprot,顯著減少(P<0.05)。在術后第二十四小時測得皮瓣中、遠端組織SOD活力二組間差異有統計學意義。結果:中端SOD活力VEGF組(116.61±19.83)nmol/mgprot,較生理鹽水組(58.27±12.81)nmol/mgprot,顯著減少(P<0.05),而遠端SOD活力VEGF組(177.07±3.41)nmol/mgprot,較生理鹽水組(109.71±40.13)nmol/mgprot,顯著減少(P<0.05)。2.2專業活檢成活率根據全自動圖像分析系統輸出結果,皮瓣形成后第七天,各組皮瓣成活率見表3。內皮細胞生長因子組皮瓣成活率較生理鹽水組明顯增加(P<0.05),二組皮瓣成活率差異有統計學意義。2.3細胞培養和織物的增殖光鏡觀察:光鏡下見二組皮瓣表皮、毛囊及皮脂腺等結構基本正常,內皮細胞生長因子組鏡下可見肉芽組織開始增生,新生毛細血管豐富,炎性細胞浸潤;生理鹽水組較內皮細胞生長因子組毛細血管數量少,炎性細胞浸潤程度重。2.4微血管密度單次給藥后3段各組微血管密度的比較皮瓣形成后第七天,用計算機全自動圖像分析系統檢測各組皮瓣近、中、遠3段微血管密度結果見表4,經統計學分析,內皮細胞生長因子組皮瓣中遠段微血管密度較生理鹽水組相應部位均有顯著增加(P<0.01)。表明內皮細胞生長因子能明顯促進皮瓣中遠段血管新生。3vegf在術后中的作用本實驗生理鹽水組和BCDE組二組皮瓣的創基均為背部肌肉,皮瓣均為任意皮瓣,除給與藥物控制不同外,二組其余均同,所以實驗結果的差別可以認為是藥物控制的不同所致。在本實驗我們觀察到,應用VEGF后,術后第二十四小時皮瓣遠端組織MDA明顯降低,較生理鹽水組比較差異有統計學意義(P<0.05),這可能由于①缺血狀態下VEGF蛋白的半衰期得到延長;②皮瓣缺血刺激內源性VEGF蛋白mRNA的產生,二者使VEGF蛋白的生物學效應從正常的30～45min,延長到6～8h,甚至更長時間。術后第十二小時毛細血管芽未見形成,VEGF未能發揮作用。待到術后第二十四小時微循環開始建立,及時發揮增加血流量,清除自由基MDA的功效。另外應用VEGF后,皮瓣中、遠端組織中SOD水平于術后第二十四小時明顯升高,VEGF組中、遠端組織中SOD含量與生理鹽水組比較差異有統計學意義(P<0.05)。可能由于SOD的增加,降低了組織中自由基水平,導致脂質過氧化水平降低,MDA也隨之下降。二者的變化都在皮瓣形成后第二十四小時最為顯著,說明VEGF能迅速改變組織內SOD的水平,加強抗氧化能力,從而有利于皮瓣遠端缺血細胞,特別是存活與壞死交界區域的“臨界”細胞減少損傷,向存活的方向轉化。Ruhul.Abid等認為VEGF能介導過氧化物歧化酶MnSOD蛋白mRNA的轉錄,繼而引起SOD蛋白合成的增加和SOD活力的提高,清除O-2,增加了內皮細胞成活,以及其抗凋亡功效;同時局部組織H2O2的產生為細胞信號轉導提供條件;但是對于VEGF引起局部組織SOD水平的升高是否也是通過加強SOD基因轉錄的機制,有待進一步研究。術后第七天第Ⅷ因子染色方法皮瓣下血管密度檢測結果顯示:VEGF組較生理鹽水組明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05)。說明當給予適量的VEGF后,能促進大量新生血管形成。術后VEGF組皮瓣存活面積較生理鹽水對照組有顯著性的增加(P<0.05),說明在皮瓣在抗氧自由基的過程中,VEGF起著重要作用,它能夠促使生理性和病理性的血管生成及內皮細胞增殖,參與皮瓣血管形成、血液循環調節,增加血流,