麥曲在黃酒釀造中的應用

小麥在大麥的生產中起著重要作用，被稱為“酒的骨架”。一方面,麥曲作為“粗酶制劑”能為黃酒釀造提供各種酶類(包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶等),促進原料中各種高分子物質水解,這些酶一部分由原料小麥自身帶入,一部分由麥曲中各種微生物分泌產生;另一方面,麥曲在固態發酵過程中產生各種代謝物,它們作為風味物質前體,賦予了黃酒獨特的風味。以往對黃酒麥曲的研究,一般是通過酶活力的測定來衡量麥曲的糖化力、液化力、蛋白質分解力等,而對于這些同功酶的構成及其來源等,往往不能進行全面而有效的分析。利用色譜等技術對麥曲中單一酶類進行純化并開展酶學性質的研究,一般只能分析單一種類的酶,不能反映麥曲中所含蛋白種類的整體情況。由此看來,傳統的酶學研究方法在研究麥曲整體的蛋白質構成及來源時具有較大的局限性。近些年來,迅速發展起來的蛋白質組學及宏蛋白質組學技術則很好地彌補了這些缺陷。KenOda等利用雙向電泳技術結合質譜分析,對米曲霉在固態培養和液態培養條件下的分泌蛋白質組進行了比較分析,共鑒定出了29種米曲霉分泌蛋白,發現固態培養條件下的特異性分泌蛋白11種,液態培養條件下的特異性分泌蛋白11種,2種培養條件下都出現的蛋白有7種。Martha等應用蛋白質組學技術研究了黃曲霉在蘆丁誘導和非蘆丁誘導下分泌蛋白質的差異,鑒定出了15種蘆丁誘導的黃曲霉特異性分泌蛋白和7種非蘆丁誘導的分泌蛋白。宏蛋白質組學(Metaproteomics)是2005年被提出的新概念,其定義是指對某一特定環境中微生物群落的所有蛋白質進行大規模的分析和鑒定。利用宏蛋白質組學理論和方法來研究麥曲浸提液中的所有可溶性蛋白(理論上應包括所有微生物分泌來源蛋白和可溶性小麥來源蛋白),目前在國內外還未見報道。本文中所指的“宏蛋白質組”定義為“黃酒麥曲浸提液中的所有可溶性蛋白質”。宏蛋白質組學的研究策略與經典的蛋白質組學研究策略相似,主要包括樣品制備、蛋白質分離和質譜鑒定3個部分。二者的主要區別在于樣品來源的不同:蛋白質組學研究主要針對一種微生物、細胞或組織,樣品來源清楚,基因組背景單一;而宏蛋白質組學所關注的是天然生境,樣品組成復雜。眾所周知,在蛋白質組學研究中,樣品制備的優劣往往決定了后續研究的優劣甚至成敗。而宏蛋白質組學研究對象的復雜性,使得其第一步樣品制備變得非常困難。如何在去除樣品中雜質的同時保持原始的樣品組成,并排除高豐度蛋白的影響,是宏蛋白質組學研究中樣品制備的重點和難點。本文以黃酒成品麥曲為研究對象,應用雙向電泳技術,比較了TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-DCleanupKit試劑盒法3種不同制備方法的雙向電泳結果,初步建立了適用于黃酒麥曲浸提液的宏蛋白質組制備方法,獲得了較為理想的雙向電泳圖譜,為后續利用質譜分析手段對宏蛋白質組中的蛋白組成進行全面、準確鑒定奠定了基礎。1材料和方法1.1材料表面1.1.1小麥的曲線由浙江古越龍山紹興酒股份有限公司、安徽省古南豐酒業有限公司、上海金楓酒業股份有限公司提供。1.1.2免疫抑制劑的制備固相IPG干膠條(pH3～10,NL,7cm)、IPGBuffer(pH3～10)、瓊脂糖、溴酚藍、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰銨(IAA),均為GE公司產品。MineralOil、Bio-RadRCDC蛋白定量試劑盒、ReadyPrepTM2-DCleanupKit試劑盒,為BIO-RAD公司產品。Complete蛋白酶抑制劑混合片,購于Roche公司。CHAPS、四甲基乙二胺(TEMED)、脲,為Amersham公司產品。丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨,為SunShine公司生產。十二烷基磺酸鈉(SDS),為進口分裝純化級產品,購于生工生物。考馬斯亮藍G-250、考馬斯亮藍R-250,為進口分裝純化級產品,牛血清白蛋白、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris堿),為生化級產品,甘氨酸、甲醇、正丁醇、甘油、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸(TCA)、丙酮、乙酸鈉,均為國產分析純產品,購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗中所用水皆為去離子水。1.1.3儀器、檢測設備等電聚焦電泳儀EttanIPGphor3(GE公司),小型垂直電泳槽(BIO-RAD公司),高電流電泳儀(BIO-RAD公司),TY-80S/80B脫色搖床(生興生物技術有限公司),JD-801凝膠電泳圖像分析系統(江蘇省捷達科技發展有限公司),Pico&Fresco17微量離心機(Thermo公司),UV-2100型紫外可見分光光度計(尼龍柯儀器有限公司),FE20K型精密數顯酸度計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。1.1.4主要溶液(1)乙酸鈉/乙酸鈉溶液和乙酸溶液配制稱取4.1g無水乙酸鈉溶于適量水中,定容到500mL,取2.86mL冰乙酸加水定容到500mL,分別為0.1mol/L乙酸鈉溶液和乙酸溶液。取適量溶液混合調至pH4.2。(2)丙酮溶液i三氯乙酸(TCA)50g,DTT1.54g,加丙酮溶解,定容到500mL。4℃保存備用。(3)丙酮溶液iiDTT1.54g,加丙酮溶解,定容到500mL。4℃保存備用。(4)溴酚蘭儲存液溴酚藍100mg,Tris堿60mg,加水定容到25mL。以一定量分裝到EP管中,4℃保存備用。(5)ffer溶液脲4.8g,CHAPS0.4g,IPGBuffer50μL,加水溶解后定容至10mL。以一定量分裝到EP管中,在-20℃冰箱中保存。使用前每1mL樣品裂解液中加入2.8mgDTT。(6)溴酚藍儲液的配制脲72.07g,SDS4.0g,1.5mol/LTris-HCl6.7mL(pH8.8),甘油69mL,溴酚藍儲液400μL,加水溶解后定容至200mL。以5mL為單位分裝,保存到-20℃冰箱中。(7)平衡液體i每5mLSDS平衡緩沖液儲存液,加入DTT50mg,充分溶解。(8)平衡液體ii每5mLSDS平衡緩沖液儲存液,加入IAA125mg,充分溶解。1.2方法1.2.1樣品制備(1)不同濃度酒精的脫酶劑稱取10g麥曲,加入20mL0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液和1片Complete蛋白酶抑制劑混合片,充分混勻后置于4℃條件下浸提12h。然后用4層紗布過濾,濾液在12000r/min,4℃下離心30min。將上清液用0.45μm的微孔濾膜過濾2次,然后以10000分子截留量的超濾離心管進行超濾濃縮。濃縮后的溶液即為黃酒麥曲的浸提液。Bradford法測定蛋白含量。(2)麥曲濕地沉淀法:cu-b(A)TCA-丙酮沉淀法:取一定量的麥曲浸提液于離心管內,加入4倍體積的預冷丙酮溶液I,充分振蕩搖勻后在-20℃冰箱中放置2h沉淀蛋白,然后4℃,12000r/min離心30min。棄上清液,收集沉淀。加入2mL預冷的丙酮溶液II,充分振蕩混勻,-20℃放置1h,清洗沉淀,4℃,12000r/min離心15min。如此重復清洗3次。棄上清液,收集沉淀,然后置于-20℃冰箱中,使丙酮完全揮發。(B)丙酮沉淀法:取一定量的麥曲浸提液于離心管內,加入4倍體積的預冷丙酮溶液II,振蕩搖勻后在-20℃冰箱中放置2h沉淀蛋白,然后于4℃,12000r/min離心30min。棄上清液,收集沉淀。加入2mL相同的溶液清洗2次,4℃12000r/min離心15min。棄上清液,收集沉淀,然后置于-20℃冰箱中至丙酮揮發完全。(C)2-DCleanupKit試劑盒沉淀法:參照試劑盒的使用說明書,取100μL麥曲提取液置于1.5mL離心管中,每管加入300μL沉淀劑I,充分振蕩混勻,冰浴15min。加入300μL沉淀劑II,振蕩混勻,4℃,12000r/min離心5min,吸出上清液。加入40μL清洗劑I,充分振蕩,4℃,12000r/min離心5min,移去上清液。在沉淀上層加入25μL去離子水,振蕩20～30s,然后在管中加入1mL清洗劑II(-20℃下至少預冷1h)和5μL清洗劑添加劑,在渦旋混合器上振蕩1min至沉淀完全散開。將離心管在-20℃下至少放置30min,每10min振蕩20～30s,然后于13000r/min離心5min,移去上清液。沉淀在空氣中風干(不超過5min)。(3)宏蛋白質組的制備將干燥好的蛋白質沉淀加入適量的樣品裂解液,室溫下充分溶解,然后于12000r/min離心10min,上清液即為黃酒麥曲浸提液的宏蛋白質組樣品。用Bio-RadRCDC蛋白定量試劑盒準確測定蛋白濃度。1.2.2由ipg凝膠層析成網,根據水質進行電泳分析使用pH3～10,7cm的非線性IPG干膠條,在Immobiline泡脹盤中被動水化14h,蛋白上樣量為110μg左右。第一向等電聚焦在EttanIPGphor3等電聚焦儀上進行,等電聚焦程序設置為:①Step,50V,30min;②Grad,150V,30min;③Grad,300V,1h;④Grad,1000V,1h;⑤Grad,5000V,1.5h;⑥Step,5000V,6000Vh。等電聚焦結束后,立即進行平衡。采用兩步平衡法,將IPG膠條先后在平衡液I和平衡液II中各平衡15min。第二向SDS電泳分離膠濃度為12.5%,應用BIO-RAD小型垂直電泳槽和BIO-RAD高電流電泳儀,以恒流方式進行電泳:10mA,10min,然后將電流調至20mA。當溴酚藍指示劑遷移到凝膠底部時,關閉電源,結束電泳。采用考馬斯亮藍染色法對凝膠進行染色。染色后的凝膠應用JD-801凝膠電泳圖像分析系統對其進行掃描,應用PDQuest8.0雙向電泳分析軟件對凝膠圖像進行分析。2結果2.1種方法制備樣品的蛋白質含量用沉淀法提取黃酒麥曲浸提液的宏蛋白質組,都不可避免地產生一定的損失。圖1是以浙江地區所產麥曲為研究對象,用TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法和2-DCleanupKit試劑盒法3種方法制備樣品,在沉淀前后溶液中的蛋白含量比較。通過計算其蛋白質損失率發現,丙酮沉淀法的蛋白質損失率最低,只有4.6%,而TCA-丙酮沉淀法和2-DCleanupKit試劑盒法制備的樣品其蛋白質損失率較高,分別達到60%和62.3%。就蛋白質的重溶時間來說,TCA-丙酮沉淀法和丙酮沉淀法制備的樣品,在樣品裂解液中較難溶解甚至不能完全重溶,往往需要振蕩溶解數個小時,并需超聲助溶;而用2-DCleanupKit試劑盒制備的樣品,溶解較容易,30min左右即可完全溶于樣品裂解液中。2.2分離效果的比較以浙江地區所產麥曲為研究對象,制備樣品進行實驗。根據黃酒麥曲浸提液宏蛋白質組的雙向電泳和染色結果,比較了TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-DCleanupKit試劑盒法制備方法的優劣。以TCA-丙酮法制備的樣品,在等電聚焦(IEF)時溴酚藍指示劑不能正常遷移到酸性端,酸性部分聚焦失敗,雙向電泳分離效果差,在2-DE圖譜上表現為酸性端有垂直的陰影(圖2-A);用丙酮沉淀法制備的樣品,其2-DE圖譜上沒有明顯的蛋白點,蛋白質呈云片狀聚集,未充分分離,雙向電泳分離效果最差(圖2-B);圖2-C是用CleanupKit試劑盒制備的樣品的結果,可以看出,其2-DE圖譜分辨率高,蛋白點圓潤、清晰,雙向電泳分離效果較好。應用PDQuest8.0雙向電泳分析軟件對凝膠圖像進行分析,TCA-丙酮沉淀法、丙酮沉淀法、2-DCleanupKit試劑盒法3種方法制備的宏蛋白質組樣品,其凝膠圖譜上的蛋白點數量分別為98、21、112個,其中,圖2-C與圖2-A和圖2-B相比,分別多檢出蛋白點14個和91個,進一步表明利用2-DCleanupKit法分離的宏蛋白質組樣品其質量要優于另外2種方法。2.3曲浸提液雙向電泳分離效果以上海和安徽地區所產麥曲為研究對象,利用2-DCleanupKit試劑盒法分別制備麥曲浸提液的宏蛋白質組進行雙向電泳實驗,結果如圖3所示。可以看出,利用該法制備宏蛋白質組樣品的2-DE圖譜分辨率均較高,蛋白點圓潤清晰,雙向電泳分離效果較為理想。說明2-DCleanupKit試劑盒法對于制備不同地區的黃酒麥曲浸提液宏蛋白質組均具有很好的通用性。3微織構巖質組學traft-雙向電泳分離體驗的比較樣品制備效果如何往往在很大程度上決定了雙向電泳的結果,特別是對于組成復雜的宏蛋白質組來說,樣品制備尤為重要。在樣品制備時,主要有3個重要目的:一是完成蛋白質的離解或蛋白質的相互作用;二是除去樣品中的非蛋白(如脂類、核酸、鹽等);三是有效降低或消除蛋白酶的活性。在此過程中,要盡量減少蛋白質的修飾和降解,樣品制備的操作步驟盡量少,時間盡量短,從而有效避免蛋白質的特異性和非特異性丟失。在雙向電泳過程中,蛋白質沉淀是可選的步驟。通過沉淀過程,可以除去影響雙向電泳結果的干擾物質,如鹽、去污劑、核酸、脂類、多糖等。另外,通過沉淀還可以有效濃縮樣品。用沉淀法制備黃酒麥曲浸提液的宏蛋白質組,需經過清洗、重溶等多個步驟,這不可避免地造成一定的損失。但從以往的研究結果來看,這種損失是整體數量上的損失,不會造成某些蛋白質的特異性丟失,可以通過適當增加沉淀的樣品量來加以彌補。TCA-丙酮沉淀法是雙向電泳最常用的制備樣品的方法,可以有效除去鹽分和多糖等雜質。TCA與蛋白質的作用包括以下幾個方面:(1)在酸性條件下與蛋白質形成不溶性鹽;(2)作為蛋白質的變性劑使蛋白質構象發生改變,暴露出較多的疏水性基團,使之聚集沉淀;(3)隨著蛋白質分子量的增大,其結構復雜性與致密性越大,TCA可能滲入分子內部而使之較難被完全除去。TCA與蛋