中藥作用機制及其靶點的研究進展

中國擁有豐富的植物資源，中傳統的中藥對疾病的治療有著悠久的歷史。中藥作為我們中華民族的文化瑰寶,在我國醫藥史上發揮了不可替代的作用。而隨著時代的不斷發展,人們逐漸意識到在傳統中藥基礎上進行創新發展的必要性。由于大多數中藥沒有明確的分子靶點,作用機制尚不清楚,許多中藥的研發無法遵循類似西藥的從先導化合物發現、優化再到備選藥物的主要研發歷程。系統構效關系研究也幾乎不可能進行,因此難以評價先導化合物對靶點的親和性和選擇性,從而無法保證讓最有效的化學實體進入臨床研究。諸如此類原因使得中藥研發難以被國際醫藥主流學術界所接受,因此用科學的方法闡釋中藥物質基礎及其作用靶點,實現中藥現代化也成為了我國許多藥物研究工作者的重要歷史責任。計算機輔助藥物設計(computer-aideddrugdesign,CADD)是通過計算機的模擬、運算來預測小分子與受體生物大分子之間的作用,包括分子對接、藥效團識別、定量構效關系等技術。利用這些手段可以從分子水平上對中藥復方中包含的小分子化合物進行研究,尋找并闡釋方中有效成分與機體靶標受體的作用情況,從而最終確定具有藥理活性的目標化合物。近年來,國內許多研究機構開始嘗試利用這項技術尋找中藥復方中的有效成分,并取得了相應的研究成果。1中藥組同關鍵分析傳統中藥復方通常由多味藥材組成,即所謂的“君臣佐使”。中藥四氣、五味以及升降浮沉、歸經等作為其各種特性的描述,均是通過藥物作用于人體產生療效而總結出的理論。“酸入肝、辛入肺、苦入心、咸入腎、甘入脾”,可見藥味與臟腑之間有著特殊的聯系規律。一般來說,中藥組分越多則作用于機體不同途徑的靶點也就越多。而且,任意一味藥材都包含許多化合物,如生物堿、黃酮、苷、醌、甾、萜、苯丙素等,因此要確證具體某個有效成分及其相應靶標成為當前藥物研究工作者的難題,解決這些問題也必將對中藥現代化、中醫方劑配伍、中藥質量控制、西藥中藥化等產生積極影響。2cdcd的應用領域CADD是隨著分子生物學、計算機科學等相應學科發展而產生的一種新的藥物研究手段,其應用領域包括全新藥物設計、數據庫篩選以及藥物的構效研究。CADD不僅能減少盲目實驗帶來的資金浪費,做到有的放矢,而且更為高效,能縮短藥物研發周期。作為一種有效的技術手段,在對中藥作用靶點的預測以及推動中藥現代化發展方面必將發揮重要作用。2.1構建生物分子數據庫中藥復方本身就是一個大的分子庫,對于其中任意一味藥材的化學成分通常能通過提取分離得到確認,因此將所有小分子進行收集整理并建立相應的分子數據庫作為待研究的對象,將有助于尋找相應的生物大分子靶點。目前,國內外開始嘗試各種中藥活性成分的搜索工作,并開發出重要的中藥化合物數據庫,其中比較著名的有TCMDatabase@Taiwan以及中國天然產物數據庫(CNPD)。2.2中藥成分及功效靶點確證是西藥開發研究的主要技術特點之一,現代藥物研究同樣也證實了中藥所具性能的客觀物質存在,每一味中藥成分都并非單一一種,包含了幾十乃至上百個化合物,即多成分共存的特質。這也正是中藥作用多靶點、多途徑,甚至是其副作用及毒性相對較小的根本所在。功能靶點是指中藥直接作用的對象,從微觀上來說藥物與機體某個部位作用產生藥效,其實質就是中藥的小分子化合物與機體生物大分子受體(酶、核酸等)相互識別結合的過程。2.2.1靶標分子的選擇對于藥效作用較為明確、單一的中藥復方,可以依據信息首先從蛋白質數據庫中檢索并搜尋出相關的靶標大分子,并且力求全面。找到這些虛擬靶標后,對其活性位點進行分析,然后以2.1中構建的中藥復方小分子數據庫與這些蛋白靶點依此進行對接,并對匹配結果進行打分,從而篩選出復方中潛在的活性成分,常用的軟件包括Dock、FlexiDock(Sybyl)等。2.2.2cytscapee預測網絡靶點這一概念的提出,促使藥物研究的重點從“單一靶點、單一藥物”向“多靶點、多藥物”轉變,這也是更具前景的新型藥物研究模式。中藥作為一個擁有多組分的小分子集合體,具備針對疾病多靶點進行協同作用的物質基礎。因此通過“網絡靶標”的篩選可以從分子層面尋找對于疾病產生作用的關鍵靶點,并發現針對這些靶點進行干預的活性化合物及相應的協同藥物組合模式。Cytoscape是一個在生物信息學上開發并得到廣泛應用的軟件包,它在生物信息網絡可視化以及數據整合研究方面十分有效。在中藥“網絡靶標”研究中,常包括藥物-靶標網絡(drug-targetnetwork,D-Tnetwork)以及藥物-藥物關聯網絡(drug-drugassociationnetwork,D-Dnetwork)兩方面研究。在D-Tnetwork分析中,是以與疾病所有相關聯的靶點與中藥中所有的化學成分構建出藥物-靶點相互作用的網絡,Cytoscape可以將所有關聯方式顯示出來,并通過數據分析將關聯度較高的一些靶點篩選出來,這些靶點即可認為是影響疾病的主要靶點。而通過D-Dnetwork分析,中藥中的某個得分高的化合物表明與多個靶標進行作用,而不僅是單一靶標,因此也可認為是中藥中的活性成分。2.2.3基于藥分析的分子庫構建中藥復方包含的化合物種類繁多,作用靶點較為復雜。而中藥之所以以其整體發揮藥效,原因可能也在于各靶點藥效之間相互配合,起到協同作用。因此,中藥藥效團模型也應區別于西藥,呈現出多樣化的特點。依據該性質,整個中藥復方小分子庫應根據藥效團的不同分為若干個分子集合。首先,在藥理學性質的基礎上推測藥物可能作用的靶標;然后尋找針對這些靶點現有的藥物或者活性抑制劑,利用其晶體結構構建出相應的藥效團模型;在基于藥效特征元素基礎上進行提問,通過藥效團識別方法對2.1中構建的分子庫進行篩選;最后,將得到的符合條件的化合物采取重新組方并進行活性測試,依據實驗結果進一步對先期預測的靶點進行驗證。3分子對接方法中藥抗腫瘤現在逐漸成為人們研究的焦點,許多中藥也被證實具有抗腫瘤功效,并通過多成分、多途徑、多靶點抑制或殺滅腫瘤細胞。多項實驗研究發現中藥抗癌機理可能包括細胞毒作用、誘導腫瘤細胞凋亡、誘導腫瘤細胞分化、調節細胞信號傳導、調節機體免疫功能、逆轉癌細胞多藥耐藥作用等。陳宇綜等應用INVDOCK進行反向對接尋找中藥中具有潛在抗腫瘤活性化合物的作用靶點。研究中首先選取了3個文獻中已經報道的中藥提取物山油柑堿、黃芪苷以及大黃素作為研究對象,其抗腫瘤作用均已被證實。通過查找藥理學資料從PDB中選取與抗腫瘤作用有關的蛋白質,并利用設定好的對接位點條件對數據庫進行過濾,進一步縮小數據庫規模。最后將3個化合物分別對候選的蛋白質數據庫進行對接篩選,結果發現了3個化合物各自的抗腫瘤靶點。其中來自植物降真香的山油柑堿主要靶標為DNA聚合酶、β-catenin蛋白和醛糖還原酶;從黃芩中分離的黃芩苷有14個潛在的抗腫瘤作用靶點,其中兩個已經通過實驗得到證實,分別是DNA聚合酶和醛糖還原酶,余下的還未得到實驗確證;而從植物大黃中提取的大黃素作用于蛋白激酶C、環腺苷酸依賴性蛋白激酶以及消炎靶標kappa-B。鄭春松等則通過選擇扶正抑瘤方和清熱消癥飲為研究對象,并結合臨床使用情況,利用分子對接的方法對中藥活性成分進行研究。首先選擇復方中靈芝、女貞子、夏枯草及白花蛇舌草作為對象,并依據文獻報道構建出復方中包含的化合物小分子庫,共計285個結構。通過藥理、藥化等有關資料,選擇了部分已經得到確證與治療腫瘤有關的靶標,結構均來自于PDB庫。對接采用Accelrys公司提供的Cerius2分子設計軟件包,通過各靶標與構建的小分子數據庫進行對接,結果發現復方中4個單味中藥自身具有多靶點效應,而且各味藥之間又存在對同一靶點相互協同以及不同靶點之間相互補充的作用。如靈芝中的化學成分作用的靶點包括表皮生長因子受體、抑制凋亡基因Bcl-x1、腫瘤壞死因子α、細胞周期依賴性蛋白激酶2;而女貞子中化合物的作用靶點除上述外還作用于血管內皮生長因子受體2、白細胞介素-2以及環氧化酶-2等。由此,進一步說明了對消化道腫瘤選擇扶正抑瘤方和清熱消癥飲聯合使用,療效更為顯著。3.2糖敏靈丸在型糖尿病治療中的應用針對Ⅱ型糖尿病的治療,現有的藥物只能從癥狀上對疾病進行調節,但卻不能根治,這在于糖尿病致病機理比較復雜,涉及的蛋白靶標眾多,因此普通藥物只能對其中某一環節發揮作用。最近由天津天士力公司開發的中藥制劑糖敏靈丸臨床上被證明能明顯改善新診斷Ⅱ型糖尿病伴代謝綜合征患者的各項指標,保護胰島β細胞功能。該制劑由11味中草藥組成,包括:柴胡、柑橘、大黃等。北京大學的許筱杰等在中藥對Ⅱ型糖尿病治療的“網絡靶標”課題研究中,對糖敏靈丸進行了分析。復方中的11味中藥成分共包含676個小分子化合物,它們的結構全部來自于貝爾斯坦(Beilstein)數據庫以及中草藥數據庫(CHDD),與Ⅱ型糖尿病相關的37個蛋白靶點從蛋白質數據庫(RSCBproteindatabank)獲得。虛擬篩選采用了Cerius2軟件中的flexibledocking程序,將37個靶點分別與676個化合物進行對接。然后利用Cytoscape2.8.1軟件分別建立藥物-靶標網絡以及藥物-藥物關聯網絡,在D-Tnetwork分析中,藥物與靶標關系的建立前提是某個化合物與其中一個靶點對接結果得分在前20名以內;而D-Dnetwork分析中,2個小分子間是否關聯取決于它們是否同時對某一個或者更多的靶點有效。最后發現糖原合成酶激酶-3β、蛋白激酶C以及胰高血糖素樣肽-1受體等與疾病的關聯較之其它靶標更為密切。而且,分析結果表明復方中起關鍵作用的某些化合物有些已被報道具有降糖作用,其它一些如大黃二蒽酮(rheidin)A、番瀉葉甙、前青花素C1等則很可能具備潛在對抗Ⅱ型糖尿病活性。由此證明中藥復方中的多組分,并同時對多靶點進行干擾可能是其發揮療效的根本原因。3.3中藥傳統模型的建立藥效團是一種基于配體的常用研究方法,張燕玲等在現代藥理研究基礎上,利用藥效團篩選方法,對活血化瘀類中藥的作用靶點進行了探討。已有研究發現中藥在防治心血管疾病方面基本通過改善微循環、改善血液流變學以及抗血栓形成等方面發揮作用,因此張燕玲等選擇了多種相應的心血管受體作為研究對象,其中包括血管緊張素轉化酶(angiotensinconvertenzyme,ACE)受體、血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)受體、血小板激活因子(plateletactivatingfactor,PAF)受體以及5-羥色胺受體。作者首先對已經明確具有活血化瘀功效的27味傳統中藥進行歸納,構建出相應的中藥化學成分三維結構數據庫,用于虛擬篩選。藥效團的構建采用Accelrys公司開發的Catalyst軟件,對上述4個ACE、AngⅡ、PAF、5-HT心血管受體抑制劑藥效團進行識別后,則分別對先期構建的數據庫進行藥效團篩選,命中結果顯示在27味中藥中有7味具有潛在的ACE、AngⅡ、PAF、5-HT受體拮抗活性,從而對中藥的作用靶點及機理進行了解釋,并且從另一側面驗證了所構建藥效團模型的合理性。研究最后將該藥效團模型對鄧中甲主編的《方劑學》中列舉的18首活血化瘀方劑進行虛擬篩選,其中包括桃核承氣湯、大黃蜇蟲湯等名方,結果顯示18首方劑中的65味中藥中,有19味包含ACE、AngⅡ、PAF、5-HT受體拮抗劑活性成分,進一步闡釋了方劑整體療效的物質基礎和作用機理。4不同結構的配體分子身份證研究中藥因其成分復雜、作用機理不明確等原因,阻礙其創新與發展,進而影響了其走向世界的進程。隨著越來越多的醫藥工作者投身于中藥現代化研究中,各種先進的技術應運而生,比如基因工程技術、酶工程技術等,都對中藥研究做出了巨大的貢獻。計算機輔助藥物設計作為一種新型的藥物研究手段,其特點之一便在于使用計算機模擬方法揭示出藥物與其受體之間的關系。而CADD技術用于中藥復方的研究中,即是傳統與現代技術的一次有效的融合,其可行性也已經得到實踐充分證明。CADD技術作為對中藥研究的一種有益嘗試,必將與其他研究手段一起推動我國的中醫藥事業不斷向前創新與發展。分子對接(moleculardocking)是依據配體與受體作用的“鎖-鑰原理”,模擬小分子配體與生物大分子受體相互作用。配體與受體相互作用是分子識別的過程,主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水作用、范德華作用等。蛋白質數據庫(proteindatabank,PDB)專門收錄蛋白質及核酸三維結構,目前該數據庫共包含77878個結構,并且每年仍以較快的速度增長。利用這一有效的結構數據資源,有學者應用“反向對接”方法進行中藥有效成分靶標的確認。其中,TarFisDock程序是利用一個小分子(藥物、先導化合物或者天然產物)與蛋白質數據庫中的蛋白質進行對接,并且每個對接結果都進行打分,最終按得分排序結果挑選出2%的候選蛋白質定為潛在的靶標,進而利用蛋白質組學方法對靶標蛋白進行驗證,依據用藥前后影響蛋白質表達的變化最終篩選出可能的作用靶點。TarFisDock可以提供一定的信息來指導實驗,在一定程度上彌補實驗能力的不足,從而對中藥作用靶標的確認提供一定的幫助,輔助中藥現代化。系統生物學表明許多復雜的疾病,如:癌癥、心血管系統疾病,其致病并非由單純某一因素引起,而是諸多基因缺陷累加的結果,因此可以推測某一疾病可以對應存在多個作用靶點。近年來多向藥理學(polypharmacology)和網絡藥理學(networkpharmacology)的興起給當今新藥