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文檔簡介
一測多評法的研究進展
中藥的特點是組件多因素的聯合使用,這表明通過測定單一成分的含量,很難全面評價中藥的整體質量。現有的中藥質量控制模式逐漸從測定單一成分向同時測定多個成分進行轉變。但是,所需中藥化學對照品種類較多、部分對照品難以制備或不穩定等因素仍然是阻礙中藥多成分質量控制發展的一個難題。一測多評法(Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-maker,QAMS)通過成分間存在的內在函數關系,僅測定一個易制備且性質穩定的成分從而實現多個待測成分的同步測定,是一種適合中藥特點的多指標質量評價模式。《美國藥典》34版有25個天然藥物及其制劑的標準使用QAMS;《歐洲藥典》7.0版有9個天然藥物標準使用QAMS;《中國藥典》2010年版黃連的質量標準使用了QAMS,以鹽酸小檗堿為內參物測定了黃連中小檗堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀4個生物堿的含量。近年來,QAMS在中藥材及中藥制劑的質量控制研究中受到了越來越多的關注,這些研究結果將為《中國藥典》2015年版中藥質量標準的制定提供參考依據。本文介紹了QAMS的基本原理及特點,概述了近8年來QAMS在中藥質量控制中的研究進展,并對研究和應用中內參物的選擇、校正因子的計算方法與耐用性考察等關鍵問題進行了探討。1多元統治的基本概述1.1測定參比及相對校正因子在一定的線性范圍內,成分的量(質量或濃度)與檢測器的響應成正比。在多指標質量評價時,以藥材中某一典型組分(對照品易得、穩定)作為內參物(k),建立內參物與其他待測組分(x)間的相對校正因子[(referencecorrectionfactor,RCF(fkx)]為公式(1):式中,Ak和Ax為內參物對照品和其他待測成分對照品的峰面積;Wk和Wx為內參物對照品和其他待測成分對照品的濃度。由公式(1)可以推導出利用RCF計算樣品中其他待測組分含量的公式(2):式中,fkx為對照品溶液測得的RCF;Ak和Ax為內參物樣品和其他待測成分樣品的峰面積,Wk為內參物樣品的濃度。1.2worm的特點1.2.1對照品純度及待測成分的測定QAMS主要適用于對照品難得、不穩定、制備成本高的情況下同類多成分的同時測定。要求對照品純度QAMS>98%,且樣品中待測成分應有相對較高的含量(≥1mg/g)。QAMS(RCF)耐用性考察、QAMS與外標法測定結果的比較,相對標準偏差都應在可接受的范圍內(RSD<5%)。1.2.2更全面、準確、科學的測定中藥質量控制了同步檢測的難度以及提高了同步測定用戶檢測成本的提高QAMS僅使用一個對照品實現對多個成分的同步測定,降低了購買分離純化困難、不穩定對照品的難度以及購買價格昂貴對照品的檢測成本,更全面、準確地對中藥進行質量控制。同時提高了同步測定多個成分的工作效率,更快捷、簡便地分析了中藥質量。建立QAMS經過系統的方法學考察且結果良好,能直接運用于含有同類成分的中藥制劑的質量控制,節約了檢測成本與檢測時間。1.3worm的使用1.3.1分析方法的評價已開展QAMS研究的中藥材或制劑多達數十種,大多都是針對同類成分的含量測定。按照化合物結構類型主要可分為對以下幾類成分的測定及應用:皂苷類成分:朱晶晶等選擇人參皂苷Rb1作為內參物,同時測定了人參中的8種人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rh1、Rc、Rb2、Rb3、Rd和三七中的3種人參皂苷Rg1、Rh1、Rd,RCF耐用性考察RSD<4%,表明在紫外吸收特征相似的同類化合物間開展QAMS研究是可行的,解決了人參等藥材質量控制中對照品供應不足的問題。王超群等以三七中的5種活性人參皂苷Rg1、Rb1、Rd、Re、R1中的任一種作為內參物,測定其他4種成分;RCF耐用性考察RSD<5%,較2010年版《中國藥典》中三七的質量標準多檢測了2個主要成分Re、Rd,表明該方法可用于三七質量的全面控制。LiYB等以淫羊藿為研究對象,一方面以淫羊藿苷為內參物測定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷Ⅰ;另一方面選擇藥材中沒有的成分蘆丁為外源內參物測定5個皂苷成分,兩種方法與外標法比較均沒有明顯的差異,表明建立的兩種方法均可以用于淫羊藿及其相關藥材或制劑的質量控制。醌類成分:GaoXY等以大黃素為內參物,建立與大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、番瀉苷A及番瀉苷B的RCF,QAMS與外標法測定結果相對誤差<0.1%,表明該方法準確可靠。王鈺瑩等以三黃片中大黃蒽醌類成分為研究對象,建立了大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚與內參物大黃素的RCF(RSD<3%),QAMS與外標法測定結果RSD<4%,表明測定的RCF可靠,被直接引用于后續新清寧片中4個蒽醌類成分的測定,證實了將經過系統考察的RCF直接應用于含相同成分中藥制劑的質量控制是可行的。吳笛等以丹參酮ⅡA為內參物,測定了復方丹參片中的二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ,QAMS與外標法測定結果無明顯差異,表明可用QAMS對復方丹參片中的丹參酮類成分含量進行評價。HouJJ等以丹參酮ⅡA為內參物,建立與隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的RCF,系統地考察了校正因子(CF)的影響因素,為QAMS的研究應用提供了參考,并且以此建立的丹參藥材質量標準已被《美國藥典》收錄。黃酮類成分:楊菲等以銀黃制劑為研究對象,選擇黃芩苷為內參物,建立與漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的RCF(RSD<5%),在后續三黃片的實驗中進一步驗證了相同成分對應RCF的準確性(RSD<2.5%),表明建立的RCF可靠;馮偉紅等直接引用該RCF測定了雙黃連制劑中相同的4個黃酮成分,與2010年版《中國藥典》僅以黃芩苷作為檢測指標相比,能更準確、全面地評價藥品質量。李愛紅等建立山奈素、異鼠李素與內參物槲皮素的RCF,重復性考察(RSD<3%),QAMS與外標法測定含量經過配對樣品t檢驗分析無明顯差異,是QAMS首次應用于銀杏葉膠囊的多指標質量評價。有機酸類成分:李安平等測定了丹參注射液中的6個水溶性成分:丹參素鈉、原兒茶醛、香草酸、阿魏酸、迷迭香酸及丹酚酸B,比較了丹參素鈉、原兒茶醛分別作為內參物時QAMS和外標法定量結果的差異,RSD分別為7.88%~33.45%、0.10%~5.22%,故選擇原兒茶醛作為內參物,測得RCF的耐用性良好(RSD≤5%),節約了多成分含量測定成本。吳笛等以含量較多、相對穩定的丹參素鈉為內參物,測定了復方丹參片中的丹參素、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B,QAMS與外標法測定結果無明顯差異,表明QAMS控制復方丹參片中丹參酚酸類成分的含量是可行的。鄭榮等以綠原酸為內參物,同時測定金銀花提取物中的新綠原酸、隱綠原酸、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸、4,5-二咖啡酰奎尼酸5個成分,解決了隱綠原酸等對照品購買不到的難題,QAMS與外標法測定結果RSD<0.1%,表明該方法可全面有效地控制金銀花提取物的質量。生物堿類成分:孔晶晶等以香連制劑為研究對象,選擇主要有效成分小檗堿為內參物,建立與表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的RCF,通過比較QAMS和標準外標法的測定結果,對不同批次的香連膠囊、香連丸、香連片的質量進行了評價。陳靜等以苦參中的氧化苦參堿為內參物,建立與槐果堿、苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿的RCF,重現性良好(RSD<4%),可作為一個穩定的參數運用于5種生物堿的含量測定。趙君穎等和劉暉暉等參照《中國藥典》2010年版黃連中的表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿4個生物堿的測定數據,分別直接測定了黃連不同炮制品、黃連配方顆粒中4個生物堿的含量。結果表明,引用已有標準中的RCF直接測定相同成分的方法是可行的,能簡便、快捷地對含有同類成分的中藥制劑進行質量控制。其他類成分:馮偉紅等以秦皮藥材和飲片中的香豆素為研究對象,建立典型成分秦皮甲素與秦皮乙素、秦皮苷、秦皮素的RCF,耐用性考察(RSD<5%),表明RCF具有一定的普適性,可為《中國藥典》秦皮的多成分質量評價提供參考。徐娜等以芹菜籽原料中的主要成分芹菜甲素為內參物,建立與芹菜乙素、新蛇床內酯的RCF,QAMS與外標法測定值無明顯差異,可為芹菜籽的質量控制提供參考依據。1.3.2糖化學和類化法檢測部分文獻考察了QAMS測定不同類成分含量的可行性,由于同時測定不同類成分對儀器及色譜柱的要求更高,使RCF耐用性考察的難度增加。王瑞等以赤芍中的芍藥苷為內參物,建立與芍藥苷類的芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷和沒食子酸類的沒食子酸、沒食子酸甲酯、五沒食子酰基葡萄糖共5個成分的RCF,耐用性考察(RSD<5%),表明可以采用QAMS測定赤芍中的不同類成分。劉志輝等以麥貞花顆粒中的蘆丁(黃酮類)為內參物,建立與羥基紅花黃色素A(單查爾酮苷類)、特女貞苷(環烯醚萜類)的RCF,耐用性考察結果良好。丁黎艷等以相對價廉易得的補骨脂素(香豆精類)作為內參物,測定了補骨脂藥材中的異補骨脂素(香豆精類)、補骨脂甲素(二氫黃酮類)、補骨脂乙素(查耳酮類),QAMS與外標法測定結果無明顯差異。HouJJ等選擇苯甲酸乙酯作為外源內參物,建立了與甘遂中的3個假白欖酮型二萜類、8個巨大戟二萜醇型二萜類、2個三萜類共13個不同類成分的RCF,t檢驗比較QAMS與外標法的日內精密度測定結果無明顯差異,并系統地考察了柱溫、流速、檢測波長等8個色譜參數對實驗的影響,為相關實驗研究提供了參考。2關于qms問題的討論2.1影響rcf的因素2.1.1rsd的優化相對于其他待測成分,內參物需滿足以下條件:在樣品中含量較高、分離制備簡單、單體較為穩定、容易購買和價格低廉。如果測定成分中有兩個以上滿足條件,可通過比較QAMS與外標法測定結果或RCF耐用性考察的RSD進行選擇。例如,丹參注射液6個水溶性成分的含量測定中,丹參素鈉與原兒茶醛均滿足內參物的選擇條件,試驗中通過比較兩個成分分別作為內參物時QAMS與外標法的測定結果,優選了RSD較小的原兒茶醛作為內參物。如果考察結果的RSD均在可接受的范圍內,則都可作為內參物以增加應用中內參物對照品的選擇。例如,中藥三七質量控制方法的系統研究中,對5個人參皂苷Rg1、Rb1、Rd、Re、R1分別作為內參物進行了系統的考察,RSD均在可接受的范圍內,則5個皂苷都可以作為內參物,應用中缺乏某一個對照品時能直接使用其他4個對照品中的任一個作為內參物,增加了對照品的選擇性。2.1.2待測成分濃度的確定CF的計算方法可根據具體的實驗條件與數據進行選擇。現有QAMS研究CF的計算方法多采用多點校正法,原理如“1.1QAMS的基本原理”所述:CF(f)=A/W,RCF=fk/fx。但是,有的CF計算方法實際為:f=W/A、RCF=fx/fk。多點校正法對于待測成分的濃度有一定的要求,濃度過低線性不準確,濃度過高對線性方程的截距會有較大的影響,都會使RCF均值偏差增大。因此使用多點校正法時,待測成分的濃度應有一個明確的范圍。何兵等提出了計算CF的另外兩種新方法:斜率校正法和定量因子校正法。斜率校正法須滿足的前提是在標準曲線A=aC+b中,C=A/a-b/a,若a/b值大于100,則忽略b/a的值,以C=A/a直接計算含量。定量因子校正法所用的CF為斜率校正法所得,計算結果與斜率校正法一致,限用于短期內、相同實驗條件下大量樣品的復檢。2.1.3檢測波長的選擇RCF耐用性指在測定條件有小的變動時RCF對影響的承受程度,主要是針對不同的儀器系統以及不同填料、不同型號的色譜柱。儀器系統的影響主要是因為檢測器的差異,色譜柱的影響則主要是對各個成分峰形(分離度、理論板數、拖尾因子等)的影響。同類成分有相似的理化性質,能適用于較多的儀器與色譜柱;不同類成分由于理化性質的不同,在不能選擇一個波長兼顧各個成分的情況下,需要選擇不同波長檢測,增加了對儀器及色譜柱的要求。檢測波長的選擇是影響RCF耐用性較為重要的因素之一。例如,對于4個相同丹參酮類成分的檢測,吳笛等用Waters、戴安的儀器及4根不同廠家的色譜柱,選擇檢測波長為248nm,李倩等用Waters、島津的儀器及3根不同廠家的色譜柱,選擇檢測波長為255nm,相同成分的RCF差異較大(RSD>5%);在麥貞花顆粒不同成分的測定中,僅使用230nm作為檢測波長時CF重現性差(RSD>5%),采用變波長檢測:0~15min選擇403nm檢測羥基紅花黃色素A、特女貞苷,15~45min選擇230nm檢測蘆丁,得到的CF重現性良好(RSD≤3%)。另外,色譜條件中的柱溫、流速、進樣體積等因素對CF也有一定的影響。實驗研究中固定這些色譜參數的設置,能將系統影響誤差降到最小。2.2檢測峰定位的影響因素由于只有內參物的對照品無其他成分的對照品,無法直接指認其他待測成分,因此如何僅用內參物定位其他待測成分是QAMS需要解決的一個關鍵問題。峰定位方法主要分為兩種:(1)待測成分與內參物的保留時間差值;(2)待測成分與內參物的保留時間比值。通常通過比較兩種峰定位方法的耐用性,選擇RSD值較小的作為定位依據,有時會輔以各個成分的紫外吸收特征,以便更準確地對色譜峰進行定位。峰定位的影響因素主要是不同儀器、不同色譜柱對各成分保留時間的影響。如,測定復方丹參片中的4個丹參酮成分時,不同色譜柱上的隱丹參酮、丹參酮Ⅰ出峰順序不一致,不能用保留時間比值或差值進行定位,需要根據峰形及各個成分的紫外最大吸收波長來確認目標峰。在
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