不同破壁方法提取黃酒麥曲中微生物總dna的比較研究

黃酒是中國的特產，享有“國酒”的美譽。黃酒的工藝、品種、口味歷經千百年的歷史沉積和文化錘煉才逐步形成了今天獨具一格的魅力和神韻,是低糧耗、低酒精度、高營養的釀造酒,是提倡發展的酒種,符合酒類市場低度、營養、保健的消費趨勢。以麥制曲、用曲釀酒是中國黃酒的特色,也是傳統操作技藝,享有“酒之骨”之稱。傳統麥曲在黃酒中既是糖化發酵的粗酶制劑,又作為少量釀酒原料和營養物質保留在黃酒中。麥曲中蘊含著一個非常復雜的混合微生物體系,在制曲過程中大量生長,產生各種酶類,為黃酒的發酵提供必需的酶類。傳統的方法研究麥曲中微生物具有很大的局限性:一是麥曲中的一些不可培養的微生物不能得到有效分離。二是只能靜態地研究麥曲中的微生物,不能動態地研究制曲過程中微生物的生長變化過程。所以,傳統方法無法弄清制曲過程中麥曲微生物生長變化情況。分子生物技術在混合微生物研究體系中的應用,極大地方便了動態研究微生物種群結構變化的情況,能夠用來了解麥曲的微生物區系和種群數量,在認識微生物群落的動態變化上具有重要的作用。微生物分子生態學是通過分析樣品中DNA分子的種類、數量等基因組信息來反映樣品中微生物細胞的種類與種群比例等信息。它克服了培養方法的局限性,直接對環境樣品中的微生物基因組DNA的組成狀況進行分析評價,所以,樣品總DNA的提取是研究的前提條件和關鍵,可靠、高效的混合樣總DNA提取方法非常重要。通常,評價一種DNA提取方法的好壞主要從5個方面考慮:(1)所得DNA具備理想的純度;(2)DNA要足夠完整,破損程度小;(3)DNA的量要充足;(4)PCR擴增產物條帶數盡可能多;(5)方法盡可能簡便、省時、費用低。麥曲樣品中成分復雜,提取麥曲樣品總DNA用于分析其中微生物的多樣性時,不僅要最大限度地提取到每個物種的DNA,而且要保證片斷足夠大,雜質少。如果用溫和的提取方法進行提取,固然可以得到大片段的DNA,但又不能保證使樣品中絕大多數的微生物破壁,會降低結果中的微生物多樣性,而用劇烈的提取方法,能將絕大多數的微生物破壁,但往往使大量DNA被剪切,從而使得到的DNA沒有分析價值。本文采用物理法(超聲波)、酶法(Yatalase酶)、化學法(氯化芐)對黃酒麥曲樣品進行破壁,提取微生物總DNA,并通過細胞裂解率、DNA的純度、片段的分布情況、ITS(內轉錄間隔區)序列擴增產物的多態性來評估不同的破壁方法對麥曲樣品總DNA提取效果的影響,確定一種合適的破壁方法來提取麥曲總DNA。1材料和方法1.1材料和樣品的預處理1.1.1材料表面黃酒麥曲樣品由黃酒公司提供。取樣后立即保存于4℃,并于48h內抽提DNA;純種微生物(米曲霉和酵母)為本實驗室保藏菌種。1.1.2懸浮液懸浮液制備無菌條件下,將粉碎好的麥曲加入帶玻璃珠的三角瓶中,加入無菌生理鹽水洗滌麥曲,將懸浮液濾紙過濾后,濾液經離心收集沉淀,4℃保存備用。取適量無菌生理鹽水洗滌純種微生物的斜面,收集菌液,4℃保存備用。1.2不同的分解方法，不同的麥曲樣品1.2.1超聲波處理根據Picard等方法改進。取樣品200mg,加入3mL提取液(0.1mol/LTris-HCl,pH8.0;0.15mol/LEDTA,pH8.0)振蕩混勻,加入0.9mL10%SDS后,超聲波(600W)在4℃冰浴下處理10min。離心,上清液0℃保存備用。1.2.2so4-3-1h42so4的制備取樣品200mg,加入3mL蘋果酸緩沖液(pH5.5)振蕩混勻,加入2%Yatalase(TaKaRa,上海)和終濃度為0.6mol/L的(NH4)2SO4,30℃保溫4h,每10min上下顛倒混勻。加入0.2倍體積的石英砂,劇烈振蕩2min,離心,上清液0℃保存備用。1.2.3酶處理過濾法根據朱衡等方法改進。取樣品200mg,加入2mL提取液(0.1mol/LTris-HCl,pH8.0;0.15mol/LEDTA,pH8.0)振蕩混勻,加入0.6mL10%SDS、3mL氯化芐和0.2倍體積的石英砂,劇烈振蕩混勻。50℃保溫1h,每隔10min振蕩混勻1次。加入1.5mL3mol/L醋酸鈉(pH5.2),冰上放置15min,離心,上清液0℃保存備用。1.3-羥基苯磺酸te的制備取保存的上清液,加入0.1倍體積3mol/L的醋酸鈉和0.6倍體積的異丙醇,冰上沉淀5min,10000r/min離心,沉淀用200μLTE溶解,加入適量RNAase,65℃水浴15min,加入200μL苯酚-氯仿(苯酚:氯仿:異戊醇=25:24:1)抽提至界面無可見物,取200μL上清液加入氯仿:異戊醇(24:1)再抽提1次,上清液加入0.1倍體積3mol/L的醋酸鈉和2.5倍體積的預冷無水乙醇,10000r/min離心10min,沉淀用70%乙醇洗滌1次,室溫放置,待乙醇完全揮發后,40μLTE溶解沉淀后,-20℃保存。1.4關于唾液和培養基的分解率計算采用血球計數板對裂解反應前后的孢子和酵母總數計數,計算裂解率。1.5總dna提取純度和濃度測定應用GeneQuantPro(Biochrom,England),將提取的麥曲總DNA樣品進行適當稀釋后,分別測定DNA樣品在260nm和280nm處的吸光值,并計算OD260/OD280的比值來確定樣品的純度、濃度和提取率。計算方法如下:式中*:OD值相當于50μg/mL的雙螺旋DNA。1.6pcr擴增真菌真菌的ITS擴增參照White等的方法。引物pITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,pITS4:5’-TCCTCC-GCTTATTGATATGC-3’(上海生物工程公司合成)被用來擴增真菌的ITS(內轉錄間隔區)保守序列。PCR擴增的反應體系為:50μL的總反應體積中含有1μLdNTP(10mmol/L),5μL10×Buffer,10mmol的MgCl2,2.5U的TaqDNA聚合酶(上海申能博彩生物技術公司),引物pITS1、pITS4各10pmol,DNA模板量80ng。擴增條件:95℃變性5min,75℃加入TaqDNA聚合酶。94℃變性1min,57℃退火1min,72℃延伸1min,31個循環后,最后72℃延伸10min。ITS-PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳,EB染色后,凝膠成像系統拍照,進行數據處理。2結果與分析2.1分離和提取dna一般提取環境樣品中的DNA有2種方法:一是直接從環境樣品中提取DNA。二是用等滲液、離心等方法使環境樣品中微生物與各種雜質分離,然后提取微生物的DNA。麥曲中的霉菌和酵母菌附著在小麥麥粒上,若直接用麥曲來提取混合微生物的總DNA,物理法的破壁效率將十分低,酶法破壁用酶量也將很大。故實驗采用無菌水沖洗麥曲至鏡檢基本無孢子和酵母后,過濾,離心濃縮,可得到麥曲中的霉菌孢子和酵母。2.2微生物的dna要對麥曲進行微生物多樣性研究,微生物的完全裂解是確保提取麥曲中所有微生物DNA的產量、質量和多樣性的前提。到目前為止,提取環境中總DNA的研究基本上集中在土壤、河流的沉淀物等的原核生物上。而對于真核生物的研究比較少,對于真菌孢子和酵母的裂解通常采用的方法有物理法(如超聲破碎法、珠磨勻漿法)、酶法(如Yatalase酶、蝸牛酶破壁法)、化學法(如氯化芐法)。實驗以米曲霉的孢子和釀酒酵母作參照,對麥曲微生物的浸提液采用了3種裂解方式,裂解率如表1所示。從表1中可以看出,采用超聲波法裂解細胞的效率最低,化學裂解法的效率最高。2.3dna提取率計算采用3種方法提取的麥曲樣品中微生物的基因組DNA,經純化后測定DNA的OD260/OD280值,計算所得DNA濃度及提取率,結果見表2。一般DNA的OD260/OD280值接近1.8最好。從表2可以看出,氯化芐法的破壁效果最好,獲得的DNA總量最多,但含有很多的雜質,純度相對較低。其次是酶法,獲得的DNA總量雖然不多,但是純度最高。通過超聲波法得到的DNA產量較低,而且雜質含量較高。2.4dna產物的序列采用不同方法提取DNA的片段的大小在瓊脂糖凝膠上的分布如圖1所示。從圖1中可以看出,采用酶法和氯化芐法提取的DNA,產物片斷分布均勻,從100bp~20kb均有。Picard等用超聲波的方法處理鏈霉菌孢子3遍,裂解率達100%,而實驗中超聲波破碎方法的破壁率很低,只有25.9%左右,原因是超聲波對真核生物的孢子和原核生物的孢子作用效果不同,得到的DNA片段長度也很小,集中分布在500bp~2000bp,不適合作為PCR擴增的模板。2.5多態性分析促進了iprc的產物3種方法提取的麥曲中微生物總dna的pcr擴增效果目前,還未能弄清楚麥曲中的微生物具體組成和制曲、發酵過程中微生物組成結構的變化情況等,傳統的純培養方式不能有效解決這些問題,分子生物技術在微生物生態上的應用,使得上述問題的解決成為可能。實驗先是結合國外非常流行的珠磨均漿法,改進了氯化芐法提取麥曲中微生物總DNA,比較了超聲波法、酶法、氯化芐法提取麥曲中微生物總DNA的效果,通過對破壁效率、純度、得率和PCR擴增效果的綜合分析,采用氯化芐法提取麥曲中微生物總DNA的破壁效率為(85.7±2.1)%、純度為1.512、得率為75μg/g曲、PCR擴增的條帶數為6條,因此選用氯化芐法提取麥曲樣品中微生物總DNA。3種不同提取方法