我國三個小型豬品系脂聯素受體1基因多態性分布

脂聯素是脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性物質。具有增加脂肪酸氧化、提高葡萄糖攝取量、改善胰島素抵抗、調控血管內皮的炎癥反應、抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉化等作用,與肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病密切相關。脂聯素通過與靶細胞膜上的G蛋白耦聯受體結合而起作用,受體包括2個亞型,分別為脂聯素受體1(AdipoR1)和脂聯素受體2(AdipoR2),脂聯素受體1在骨骼肌中表達豐富,在調節機體胰島素敏感性及糖脂代謝中發揮重要作用。為促進我國小型豬在糖尿病和代謝性疾病研究中的應用,我們選取脂聯素受體1基因第5外顯子至第5內含子之間一段長為366bp的基因片段,探討其在在中國農大小型豬、廣西巴馬小型豬和五指山小型豬中的多態性變化。1材料和方法1.1國際農業大學提供了小型豬廣西巴馬小型豬(6頭),由廣西大學動物科學技術學院提供;中國農大小型豬(10頭),由北京市琉璃河科興實驗動物養殖中心提供;五指山小型豬(6頭),由中國農業科學院畜牧獸醫研究所提供。1.2方法1.2.1提取dns取上述小型豬的血液各5mL,使用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒提取血液基因組DNA,-20℃保存備用。1.2.2pcr擴增產物的合成參考Izabela等的研究結果,以GenBank登錄的序列為模版設計引物(GenBank登錄號:AY8275691),上游引物:5’-ttcgggagaaggtggtgtttg-3’;下游引物:5’-tagcactgctcggggagaaaatac-3’送北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。PCR擴增產物片段位于外顯子5~內含子5,長度為366bp。利用上述提取的3個品系小型豬的DNA進行PCR擴增,反應體系(50μL)包括:ddH2O,21μL;上下游引物,2μL;Mastermix,25μL;基因組DNA,2μL。反應條件:94℃預變性4min,94℃變性45s,59℃退火45s,72℃延伸45s,共35個循環,末次循環后72℃延伸10min。反應結束后,取5μLPCR產物于0.8%瓊脂糖凝膠中電泳,用凝膠成像系統觀察電泳結果。1.2.3分離產物的測序結果及應用一般自變量pcr產物測序結果通過規劃u2005-20將PCR產物委托北京利嘉泰成科技有限公司進行純化測序(單向測序):利用DNASTAR對PCR產物測序結果進行BLAST分析,并根據以下兩個原則確定SNPs:①變異位點處雜合子的測序峰高相對純合子的而言有明顯的降低;②雜合子還會出現另一種測序峰。2結果2.1附加產品的鑒定成功擴增出目的基因片段,長度366bp,電泳結果見圖1。2.2ade檢測的細胞系統snps分析以中國農大小型豬,廣西巴馬小型豬和五指山小型豬的DNA為模板,用特異性引物擴增AdipoR-1基因外顯子5~內含子5的部分片段(366bp),測序并利用DNASTAR軟件BLAST分析測序結果,共篩查到5個SNPs,各多態變化見表1和圖2(圖2見插Ⅶ)。3重要外顯子和內含子檢測2003年,Yamauchi等應用分子克隆技術確定人的脂聯素受體存在兩種異構體,分別稱為脂聯素受體1(AdipoR1)和脂聯素受體2(AdipoR2),其中脂聯素受體1位于染色體1p36,包括8個外顯子和7個內含子,其中外顯子1、外顯子2的部分片段、外顯子8的部分片段是非編碼區,人脂聯素受體1基因的結構如圖3所示。2004年,Ding等克隆了豬的AdipoR1,將其定位于10p13,共編碼了375個氨基酸,與人類AdipoR1基因的同源性是97%。脂聯素受體1對球狀脂聯素的親和力較高,在肌肉組織中起到介導球狀脂聯素促進脂肪酸氧化、葡萄糖攝取和增強胰島素敏感性的作用。Damcott等在安曼人AdipoR1基因中檢測出5個單核苷酸多態性(SNPs),發現AdipoR1基因的3個內含子與安曼人2型糖尿病明顯相關。Wang等觀察了高加索、美洲和非洲的2型糖尿病患者中AdipoR1基因的8個外顯子和兩側的內含子,確定了22個SNPs并記錄了14個序列變異,但是這些SNPs和2型糖尿病無關聯,也不是高危家族非糖尿病成員胰島素敏感性和胰島素分泌的決定因素。可見,脂聯素受體1基因與2型糖尿病的相關性存在著種族的差異。Izabela等研究了豬AdipoR1的外顯子5至內含子5之間的一段長為366bp的片段,結果顯示,該片段中不存在有意義的多態性變化。本文參考Izabela的研究,在三個品系小型豬的基因組DNA中成功擴增出目的片段,但是所得到的結果與Izabela等的研究結果完全不同。本實驗共檢測出了5個SNPs。SNP1:G138A,所有的樣本都出現該變化,并導致第45位氨基酸由甘氨酸(Gly)變為谷氨酸(Glu)。SNP2:G185A,所有的純合突變均發生在五指山小型豬品系中(4/6,66.67%),而所有的雜合突變則發生在中國農大小型豬品系中(3/10,30%)。SNP3:G200A,全部發生在中國農大小型豬品系中,且均為雜合突變(3/10,30%)。SNP4:C295T,發生在廣西巴馬小型豬品系中的突變既有雜合突變(1/6,16.67%)也有純合突變(2/6,33.33%),發生在中國農大小型豬品系中的突變全為雜合突變(2/10,20%),可能是因為小型豬品系之間存在著差異,也可能是個體之間的存在著遺傳差異的原因。SNP5:T337G,只出現在中國農大小型豬品系中,且為雜合突變(1/10,10%),只有一個樣本發生該點變化。在本實驗中,SNP2~SNP5都位于內含子5中,可能是不同動物品系的遺傳差異所致,而SNP1的突變率達到100%,而且引起了氨基酸的改變,表明這一位點可能是我國小型