鹽脅迫下甜瓜轉錄因子表達的表達變化

土壤鹽分是一個全球生態環境問題，是植物生長發育和農業生產的主要因素之一（zhang等人，2011）。甜瓜是我國重要的經濟栽培作物。葫蘆科中,甜瓜的耐鹽性僅次于南瓜,但較高的鹽分也會對甜瓜栽培造成危害(Botía等2005),如抑制甜瓜生長、影響代謝、降低產量及品質等(Mendlinger和Fossen1993;Franco等1997;Carvaja等1998;Mavrogianopoulos等1999;delAmor等2000)。研究甜瓜耐鹽機制對于了解作物耐鹽性和鹽漬化土壤改良具有重要意義。甜瓜耐鹽性的研究主要集中生理特性方面,如在鹽脅迫下甜瓜的離子濃度、氣孔開度、光合能力、抗氧化酶活性等方面(Mendlinger和Paster-nak1992;Mavrogianopoulos等1999;delAmor等2000;Rodríguez-López等2000;Sivritepe等2005)。利用分子生物學手段來研究甜瓜鹽脅迫下的轉錄調控鮮有報道。轉錄調控是植物對逆境脅迫產生應答的關鍵步驟(Kawaura等2008),轉錄因子在植物對逆境脅迫的應答過程中有重要作用。當植物受到逆境脅迫時,轉錄因子會與相應的順式作用元件結合啟動相應基因的轉錄表達,調控并減輕逆境脅迫給植物帶來的傷害(劉強等2000)。研究鹽脅迫下植物轉錄因子表達的特性和規律對揭示植物耐鹽機理具有重要意義。轉錄組研究發現大量轉錄因子在鹽脅迫條件下表達發生變化。利用微陣列技術分析鹽脅迫條件下擬南芥轉錄組的變化,發現有289個轉錄因子受鹽脅迫誘導上調表達,139個轉錄因子的表達被抑制(Jiang和Deyholos2006)。同樣,在苜蓿中發現171個基因被鹽脅迫誘導而上調表達,其中20%是轉錄因子(Gruber等2009)。本研究利用新一代高通量測序手段——轉錄組測序(RNA-Seq)技術,通過轉錄組分析來研究不同品種甜瓜葉片中鹽脅迫響應轉錄因子表達特性,以期更好地理解甜瓜對鹽脅迫響應的分子機制,增加對作物耐鹽機理的認識,并為培育耐鹽品種提供參考。材料和方法1試驗材料和材料本試驗采用2種不同地區的甜瓜(CucumismeloL.)品種‘冰雪脆’(‘BXC’,產地濟南,光皮)和‘玉露’(‘YL’,產地臺灣,網紋)為試驗材料。2基質處理與鹽析本試驗于上海交通大學農業與生物學院現代農業工程訓練中心玻璃溫室區進行。選取籽粒飽滿、大小一致的種子,浸種催芽后播種于盛有混合基質(蛭石:珍珠巖=1:1)的128孔穴盤中。萌發后每隔2d澆1/2“花無缺”營養液(N:P:K=20:20:20)(上海永通化工有限公司),培養基質含水量維持在相對濕度75%左右。待幼苗長到兩葉一心時,移栽到20L的PVC桶中(每桶種1株),所用混合基質為草炭:蛭石:珍珠巖:有機肥=4:4:1:1,測定基質的EC值為1.0,pH為7.03。溫室條件為日溫24~28℃,夜溫18℃;光周期14h·d-1(光照強度大于87.5μmol·m-2·s-1)。以去離子水為對照,用300mmol·L-1濃度的NaCl溶液進行處理。為避免鹽沖擊效應,采用每天遞增75mmol·L-1鹽濃度方式處理。達終濃度后每隔2d澆足量終濃度鹽溶液,以沖洗基質中殘留鹽分,保證基質鹽濃度在最小的范圍內波動。期間視需要同時澆以“花無缺”營養液。每個處理隨機取樣3株,重復3次。在達到終濃度后第7天時進行葉綠素熒光指標的測定和分析,且取甜瓜葉片經液氮處理并于–80℃下保存備用。3葉片光化學活性測定將各處理植株充分暗適應30min以上,用FMS-2型便攜式熒光儀(英國Hansatech公司)在室溫下測定每株葉片暗適應下的光系統II最大光化學效率(Fv/Fm)、初始熒光(F0)和光化學量子效率(ФPSII)。每個指標測定重復6次,取平均值。利用MicrosoftExcel2007整理測定數據,采用SigmaPlot11.0作圖,方差分析用SAS9.0處理。4rna提取方法按Trizol試劑盒(Invitrogen公司,美國)說明書提取總RNA,并用RNeasyMini試劑盒(Qiagen公司,荷蘭)純化。用NanoDrop-1000分光光度計測定所抽提RNA樣品的A260、A280值,計算樣品濃度,并用變性瓊脂糖凝膠電泳定性檢測所提取RNA的質量。每個處理取3個生物學重復的RNA樣品混合為50μL,用于RNA-Seq轉錄組測序。5轉錄組測序高質量RNA樣品由上海翰宇生物科技有限公司進行測序文庫構建,利用IlluminaHiSeq2000高通量測序平臺對文庫進行轉錄組測序,具體方法參見Xu等(2012)。利用basecalling將測序后得到的原始圖像數據轉化為序列數據,即原始序列數據(rawreads)。6差異表達基因的計算用Tophat軟件(Trapnell等2009)將去除接頭和低質量后得到的Cleanreads比對甜瓜基因組序列(Jordi等2012),隨后利用Cufflinks軟件(Trapnell等2010)組裝比對結果,得到Unigenes,并且根據RPKM(ReadsPerKilobaseofexonmodelperMillionmappedreads)方法計算樣本間的基因表達差異。在本研究中,以B0(‘冰雪脆’,無鹽處理)、Y0(‘玉露’,無鹽處理)作為對照,將相對應的B2(‘冰雪脆’,300mmol·L-1NaCl處理)、Y2(‘玉露’,300mmol·L-1NaCl處理)符合P<0.05且差異倍數在2倍以上的基因定義為差異表達基因。通過Blast2-GO軟件對Cufflinks組裝得到的所有Unigenes與NCBI的nr蛋白質序列數據庫比對,對Unigene進行功能注釋和分類(Conesa等2005)。7熒光定量檢測選擇差異表達的NAC、WRKY和MYB家族的各2個轉錄因子,用PrimerPremier5軟件設計引物(表1),進行實時熒光定量PCR分析。將各樣品次生物學重復的RNA采用第一鏈cDNA合成試劑盒(Takara公司,日本)反轉錄為cDNA,以反轉錄產物為模板,以Actin為內參,采用QIAGEN公司的SYBRGreenRT-PCR試劑盒,利用FTC-3000qPCR系統(FunglynBiotech公司,上海)進行熒光定量檢測。各樣品每個基因重復3次,按2-uf044uf044Ct相對定量法進行定量計算相對表達量。結果1鹽脅迫對‘玉露’和‘冰脆’f0和psiii的影響由圖1可以看出,300mmol·L-1NaCl脅迫‘冰雪脆’和‘玉露’后,F0、Fv/Fm和ФPSII值與對照組相比有不同程度的下降。和對照相比,鹽脅迫后,‘玉露’的F0由0.7下降到0.65,下降幅度為7.7%;‘冰雪脆’的F0由0.81下降到0.43,下降幅度為47.3%,品種間差異顯著。‘玉露’和‘冰雪脆’的Fv/Fm分別在鹽脅迫后下降18.01%和47.35%,ФPSII分別下降了15.12%和48.11%。品種間比較可以看出,‘玉露’的F0、Fv/Fm和ФPSII值均高于‘冰雪脆’中的,品種間差異顯著。2轉錄組基因轉導率meloc-tki與對照相比,‘玉露’在鹽脅迫下共有56個轉錄因子的轉錄水平發生了改變。其中,上調表達的轉錄因子基因22個,上調倍數在7.31~61.82之間,其中最大上調基因為MELO3C020971。轉錄水平下調表達的有34個,下調倍數在7.89~243.88,其中MELO3C01364基因下調243.88倍。‘冰雪脆’在鹽脅迫下與對照相比,共有47個轉錄因子轉錄本表達發生變化(表2)。其中,上調表達有17個,上調幅度在6.19~94.35倍之間;下調表達的30個,表達幅度變化在7.16~141.04倍之間。3轉錄因子基因不同甜瓜品種響應鹽脅迫品種響應轉錄因子的變化表現出品種特異性(圖2)。‘玉露’所涉及的56個鹽脅迫響應轉錄因子中有29個基因表現出品種特異性,占總數的51.8%。其中轉錄水平上調表達的轉錄因子基因有13個,下調的有16個。‘冰雪脆’在鹽脅迫下有20個特異響應的轉錄因子,占所有應答轉錄因子基因的42.6%。其中鹽脅迫抑制的基因有12個,鹽脅迫誘導的有8個。‘玉露’和‘冰雪脆’對鹽脅迫共同響應的轉錄因子有27個,其中有9個為上調表達,18個表現為下調表達。4轉錄因子家族結果(表3)表明,甜瓜在鹽脅迫下有25個轉錄因子家族的差異表達。其中差異表達顯著且包含轉錄因子數量較多的轉錄因子數較多的家族有AP2/EREBP、NAC、Homeobox、WRKY、MYB、Zincfinger、Ttcp7/9、bHLH和Gata等。鹽脅迫下葉綠素熒光含量變化幅度較小的‘玉露’其表達發生變化的56個轉錄因子轉錄本屬于19個轉錄因子家族。表3和4可以看出,NAC家族上調表達的轉錄因子最多,為6個(27.3%),上調表達幅度最大的是MELO3C017185為61.119倍;Zincfinger家族下調表達轉錄因子最多,為7個(22.6%)。有的轉錄因子家族既有轉錄水平上調的,也有轉錄水平下調的,如MYB家族、NAC家族和ERF家族。與‘冰雪脆’相比,homeobox-leucinezipperproteinathb-7和heatstresstranscriptionfactorb-3是‘玉露’特有的鹽脅迫應答轉錄因子,并且此兩類轉錄因子主要表現為上調表達。‘冰雪脆’中表達發生變化的轉錄因子轉錄本屬于20個轉錄因子家族,其中上調表達幅度最大的是NAC家族的MELO3C017185,表達量上調了94.136倍,下調表達幅度最大的是MYB家族中的MELO3C006313,下調了141.04倍。4個轉錄因子家族中的轉錄因子轉錄本在鹽脅迫下轉錄水平表達上升和下降同時存在,這些家族分別為AP2/EREBP、NAC、MYB、Zincfinger家族。與‘玉露’相比,‘冰雪脆’特有鹽脅迫應答轉錄因子為HDdomainclass、palmate-likepentafoliata1和mixta-liketranscriptionfactor,并且這些轉錄因子主要表現為下調表達。‘冰雪脆’和‘玉露’共同上調的轉錄因子家族有AP2/EREBP、NAC、WRKY和MYB家族;共同下調的轉錄因子家族有AP2/EREBP、NAC、MYB、Zincfinger、bHLH、Ttcp7/9、Gata、transcriptionactivatorglk1-like和GRAS,這些共性的轉錄因子可能是甜瓜耐鹽性研究重要的分子線索。5pcr對鹽處理前后表達的影響分別選取‘玉露’和‘冰雪脆’中NAC、WRKY和MYB家族的2個基因,利用實時熒光定量PCR對其鹽處理前后表達變化進行分析。由熒光定量結果(表5和圖3)可以看出,雖然在表達變化幅度上有些差異,但從6個基因的表達趨勢來看,實時熒光定量分析結果與轉錄組分析結果基因的表達趨勢基本一致,說明Illumina測序獲得的轉錄組數據的可靠性。鹽脅迫反應中anyf轉錄因子轉錄調控是植物對逆境脅迫產生應答的關鍵步驟,轉錄因子在植物對逆境脅迫的應答過程中發揮重要的作用。目前已經鑒定出AP2/EREBP、MYB、WRKY、NAC以及bZIP/HD-ZIP等轉錄因子家族的成員參與了植物對鹽脅迫的應答反應(朱冬梅等2010),特定轉錄因子表達水平的變化能極大地影響植物適應逆境的能力。轉錄因子在鹽脅迫下呈現出不同的應答反應模式,表明這些轉錄因子在鹽脅迫應答途徑中扮演著不同的角色(Jiang和Deyholos2006;Kawaura等2008;Gruber等2009)。本文研究結果表明,鹽脅迫可以誘導或抑制眾多轉錄因子表達,且不同品種甜瓜的轉錄因子在其轉錄水平表現出一定的品種特異性。鹽脅迫下,兩個甜瓜品種‘玉露’和‘冰雪脆’葉片的葉綠素熒光參數相差較大,說明兩個品種在耐鹽性方面有一定的差異。‘玉露’有51.8%的轉錄因子是鹽脅迫特異響應,‘冰雪脆’中則有42.6%的鹽脅迫逆境響應轉錄因子表現為特異響應。鹽脅迫下2種甜瓜品種表現的不同葉綠素熒光參數也體現了2個品種鹽脅迫時轉錄水平調控方式可能有所差異,其鹽脅迫的適應機理可能也有所差異。由于轉錄因子數目眾多,其調控方式表現出豐富的多樣性,測序數據分析結果也可以看出這兩個品種在鹽脅迫逆境下,有的轉錄因子家族中既有上調表達的,也有下調表達。這種表達的差異可能是植物重新組織和調節生理生化活動,以提高或改善某些代謝途徑來適應鹽逆境脅迫,減少傷害。兩種甜瓜在鹽脅迫條件下所表達的轉錄因子也有部分相同,表明其在鹽脅迫時有某種相同的反應機制,這種機制可能與基礎抗性有關。植物AP2/EREBP轉錄因子家族能夠對包括鹽脅迫在內的多種非生物脅迫產生應答(Kizis等2008)。本研究發現甜瓜響應鹽脅迫的AP2/EREBP轉錄因子大部分屬于ERFs轉錄因子家族(ethylene-responsivefactors)。ERF廣泛參與植物生長發育及各種逆境脅迫反應的調控(莫紀波等2011)。如對轉入ERF類轉錄因子OPBP1基因的煙草分析發現,OPBP1的過表達能提高煙草的抗鹽能力(劉文奇等2002);番茄ERF類轉錄因子JERF3既是GCC-box結合蛋白,又能識別DRE元件。JERF3在番茄中能被乙烯、茉莉酸、低溫、高鹽和脫落酸誘導,同時能提高轉基因煙草的耐鹽性(Wang等2004)。本研究中,部分AP2/EREBP基因參與甜瓜應對鹽脅迫的分子調控過程,2種甜瓜中表達發生變化的AP2/EREBP基因大都不同且數量也不同。在‘玉露’中有11個,其中4個上調表達,7個下調表達;‘冰雪脆’中有6個,其中僅有1個表現為上調。在鹽脅迫下,一些AP2/EREBP基因表現為上調,而另一部分基因卻表現為表達抑制,說明不同的基因參與環境脅迫響應的調節方式不同。近幾年,植物ERFs轉錄因子在基因克隆和功能研究方面取得了很大進展,但目前對ERFs轉錄因子整體調控機制還不很明確(莫紀波等2011)。ERFs轉錄因子在植物脅迫應答反應中的深入研究,將為培育耐逆性作物新品種提供參考。植物對逆境脅迫的應答與NAC家族轉錄因子有密切關系(Purani等2012;Nakashima等2012)。對普通小麥的轉錄組分析發現53個NAC基因中有23個NAC基因受鹽脅迫誘導上調表達(Glenn等1999)。NAC家族基因在擬南芥根部對NaCl應答最為顯著,表明它是擬南芥根部對鹽脅迫應答反應中潛在的重要調節因子(Vannini等2004;Jiang和Deyholos2006)。本研究也檢測到受鹽脅迫誘導的NAC類轉錄因子,在‘玉露’和‘冰雪脆’中上調表達的NAC類轉錄因子都比下調表達的多,表明這兩種甜瓜中NAC轉錄因子在鹽脅迫下主要通過誘導表達起調控作用。植物中對鹽脅迫特異性應答以及超高水平應答的NAC轉錄因子過表達大多能使轉基因植物提高一種或幾種脅迫耐受性,對植物耐鹽基因工程具有重要參考價值(李小蘭等2013)。WRKY基因在植物體內的表達受生物和非生物環境的誘導,其表達具有快速、瞬時等特點(Zhou等2008)。在葡萄中,逆境相關的信號物質,如脫落酸、高鹽和低溫等逆境脅迫均可誘導3個WRKYs基因的表達,表明WRKYs參與了葡萄抵御逆境脅迫的過程(侯麗霞等2013)。本研究也檢測到在鹽脅迫下不同甜瓜品種中WRKY均為上調表達,表明它是甜瓜對鹽脅迫應答反應中潛在的重要調節因子,主要通過上調表達對作物起