第二章神經(jīng)生物學(xué)研究的方法和手段一、形態(tài)學(xué)方法二、生理學(xué)方法三、電生理學(xué)方法四、生物化學(xué)方法五、分子生物學(xué)方法六、腦成像（Brainimaging）技術(shù)一、形態(tài)學(xué)方法束（通）路追蹤法

熒光組織化學(xué)法原位雜交法受體定位法神經(jīng)系功能活動(dòng)形態(tài)定位法

1、束（通）路追蹤法：研究神經(jīng)元之間的聯(lián)系

軸漿運(yùn)輸法—利用神經(jīng)元軸漿運(yùn)輸現(xiàn)象的追蹤法.

追蹤劑：辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxoidase,HRP)、熒光染料包括核黃(nuclearyellow)、固藍(lán)(fastblue)及熒光金(fluorogold)、植物凝集素如麥芽凝集素(wheatgermagglutinin,WGA)和菜豆凝集素(phaseolusvulgarisagglutinin)、細(xì)菌毒素如霍亂毒素、病毒如活的神經(jīng)病毒

(胞疹病毒和彈狀病毒）

l

變性法：利用神經(jīng)元包體受損或神經(jīng)軸突離斷后遠(yuǎn)側(cè)軸突的變性，或軸突切斷后細(xì)胞的反應(yīng)，來(lái)研究纖維的聯(lián)系。*物理性方法：刀的切割、電凝、電離破壞、超聲破壞等。*化學(xué)性破壞：興奮性氨基酸（海人酸和鵝高蕈氨酸）、單胺類(lèi)神經(jīng)毒（６－羥多巴胺、６－羥多巴、雙羥色胺）

神經(jīng)元質(zhì)膜熒光染料法：

用羰花青（carbocynine）熒光染料，可以染出神經(jīng)細(xì)胞的質(zhì)膜，并可以在活體或固定的標(biāo)本上追蹤纖維聯(lián)系。

２、熒光組織化學(xué)法

用特異性抗體顯示神經(jīng)組織化學(xué)成分的方法。基本過(guò)程有：固定、制片、反應(yīng)等三步。l

免疫組織化學(xué)反應(yīng)：有直接法和間接法l雙重免疫組織化學(xué)染色：主要是為了研究?jī)煞N物質(zhì)在同一細(xì)胞或突起內(nèi)的共存現(xiàn)象，或含兩種不同化學(xué)物質(zhì)的相互關(guān)系。３、原位雜交法

在形態(tài)學(xué)研究中，主要用于顯示細(xì)胞內(nèi)的mRNA。

４、受體定位法：研究受體在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的定位

配體法：主要在組織切片上進(jìn)行，利用標(biāo)記的配體和受體結(jié)合以示蹤其部位

免疫組織化學(xué)法：用針對(duì)受體的抗體

原位雜交法５、神經(jīng)系功能活動(dòng)形態(tài)定位法

脫氧葡萄糖法：原理是：神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)其能量代謝增加，而其能量代謝主要依賴葡萄糖。在腦內(nèi)存在脫氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2DG)時(shí)，神經(jīng)元可不加區(qū)別地將2DG與葡萄糖一起攝入細(xì)胞內(nèi)，兩者都是己糖激酶的底物。但2DG在其被磷酸化成2DG-6-PO4后，不能被磷酸己糖異構(gòu)酶進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為果糖-6-PO4，不能繼續(xù)在糖酵解循環(huán)中代謝。如在2DG上標(biāo)以同位素。神經(jīng)元內(nèi)同位素的堆積程度反映了神經(jīng)元的活動(dòng)程度。

c-fos(Fos)法：c-fos是一種原癌基因，屬于即刻－早期基因類(lèi)(immediate-earlygene).很多刺激條件可通過(guò)第二信使引起神經(jīng)元c-fos的表達(dá)增加，形成fosmRNA。由fosmRNA翻譯成的Fos蛋白，立即轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與另一即刻早基因c-jun所產(chǎn)生的蛋白Jun構(gòu)成二聚體（第三信使），調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，引起一系列的細(xì)胞反應(yīng)。

細(xì)胞色素氧化酶法：

神經(jīng)元線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶是提供神經(jīng)元能量的重要酶，細(xì)胞色素氧化酶的水平與神經(jīng)元能量需求密切相關(guān)，一般反映慢性刺激的結(jié)果。

二、生理學(xué)方法

損毀法

刺激法周身給藥法腦室注射法腦組織培養(yǎng)亞細(xì)胞分析神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測(cè)定

神經(jīng)遞質(zhì)的功能測(cè)定

行為學(xué)方法

1、神經(jīng)遞質(zhì)釋放量的測(cè)定（在體invivo和離體invitro)推挽灌流法：

在體研究中樞核團(tuán)遞質(zhì)釋放的有用方法。通過(guò)推挽灌流套管，使灌流液直接灌流腦組織，從流出液中分析神經(jīng)遞質(zhì)的變化。

腦透析術(shù)(braindialysis)：在特定的腦區(qū)內(nèi)，植入透析探頭，用生理溶液灌流時(shí)，細(xì)胞外液中的神經(jīng)遞質(zhì)可順濃度遞度從透析管擴(kuò)散至灌流液中，收集和測(cè)定灌流液中神經(jīng)遞質(zhì)的含量，就能監(jiān)測(cè)該遞質(zhì)的變化過(guò)程。腦透析術(shù)的裝置包括探頭、導(dǎo)管、微量灌流泵、樣品收集器和定量分析儀。

抗體微探針?lè)ǎ菏窃诓Ａ㈦姌O上涂上一層神經(jīng)肽抗體，用于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)定位神經(jīng)肽的釋放。硼硅玻璃與r－氨丙基三乙氧硅烷（r-aminopropyltri-etriethoxysilane）反應(yīng)后在玻璃表面形成一層帶有游離氨基的硅氧烷(siloxane)多聚體微粒。該玻璃再用戊二醛(glutaraldehyde)處理，使戊二醛與蛋白質(zhì)A以共價(jià)鍵方式偶聯(lián)，蛋白質(zhì)A再與神經(jīng)肽抗體結(jié)合，制成抗體微探針腦片灌流法

突觸體灌流法2、神經(jīng)遞質(zhì)的功能測(cè)定

微電泳：能將微量的神經(jīng)遞質(zhì)導(dǎo)入神經(jīng)元附近，觀察其作用。抗體微量注射：特異性的抗體注射在某些部位，可中和神經(jīng)末梢釋放出而進(jìn)入突觸間隙的神經(jīng)肽，防止其與受體結(jié)合。因此，抗體微量注射所引起的功能變化可解釋為消除該神經(jīng)肽的生理效應(yīng)的結(jié)果。生物檢測(cè)（Bioassay）:經(jīng)典的方法.如用水蛭背最長(zhǎng)肌測(cè)定ACh的作用，靈敏度達(dá)10-10g.3、行為學(xué)方法

l

經(jīng)典條件反射：代表了刺激與強(qiáng)化的關(guān)系。l操作式條件反射：是通過(guò)動(dòng)物自身的某個(gè)特定操作動(dòng)作而獲得食物或回避有害刺激的反應(yīng)活動(dòng)。

三、電生理學(xué)方法

1、電生理常用儀器

陰極射線示波器:高靈敏度，掃描速度慢

生物電放大器

電子刺激器

貯存和分析電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果的儀器：如示波器照相機(jī)和計(jì)算機(jī)。2、電生理學(xué)的常用方法

細(xì)胞外記錄(Extracellularrecording)：把引導(dǎo)電極安放在神經(jīng)組織的表面或附近引導(dǎo)神經(jīng)組織的電活動(dòng)。胞內(nèi)記錄(Intracellularrecording)：研究神經(jīng)元基本生物物理特性的有力手段。EPSP,IPSP,AP(動(dòng)作電位)腦內(nèi)電刺激：是研究中樞功能定位的方法之一。

順行沖動(dòng)記錄法(Orthodromicimpulserecording)：就是電刺激某一突觸前的細(xì)胞體、樹(shù)突或軸突，在此突觸后神經(jīng)元細(xì)胞體上記錄此刺激引起的電活動(dòng)變化。逆行沖動(dòng)記錄法(Antidromicimpulserecording)：逆行沖動(dòng)記錄法即電刺激神經(jīng)元的軸突主干或末梢，在同一神經(jīng)元胞體記錄反相傳導(dǎo)的動(dòng)作電位。

電壓鉗技術(shù)(VoltageClamp)：通過(guò)插入細(xì)胞內(nèi)的一根微電極向細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)充電流，補(bǔ)充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，這樣即使膜通透性發(fā)生改變時(shí)，也能控制膜電位數(shù)值的不變。經(jīng)過(guò)離子通道的離子流與經(jīng)微電極施加的電流方向相反，數(shù)量相等。

SG:信號(hào)發(fā)生器，F(xiàn)BA:反饋放大器，V監(jiān)測(cè)膜電位膜(斑)片鉗技術(shù)（PatchClamp