本章內容提要:第一節細胞形態結構的觀察方法第二節細胞及其組分的分析方法第三節細胞培養、細胞工程第四節細胞及生物大分子的動態變化第五節模式生物與功能基因組的研究第三章細胞生物學研究方法第一節細胞形態結構的觀察方法光學顯微鏡:以可見光為光源電子顯微鏡:以電子束為光源一、光學顯微鏡技術（一）普通光學顯微鏡1.結構:①照明系統:光源和聚光器②光學放大系統:物鏡和目鏡③機械裝置:用于固定材料和觀察方便雙筒顯微鏡單筒顯微鏡2.原理:經物鏡形成倒立實像,再經目鏡進一步放大成像。3.幾個概念:①放大(率)倍數:顯微鏡最后形成的物體放大像與被檢物體的大小比例,即像高比物高。②分辨力(resolvingpower):指顯微鏡（或人的眼睛距目標25cm處）能分辨物體最小間隔的能力。③數值孔徑(鏡口率)（NumericAperture）：NA=ｎsin(α/2)光學顯微鏡的分辨力R=0.61λ/N.A．其中λ為入射光線波長；N.A．為鏡口率

＝ｎsin(α/2)；n=介質折射率；α=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角）。表一、幾種介質的折射率4.顯微鏡的幾個光學特點制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65~1.78，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。鏡口角總是要小于180，所以sin(a/2)的最大值必然小于1對于干燥物鏡來說，介質為空氣，鏡口率一般為0.05~0.95；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近1.5。普通光線的波長為400~700nm，因此普通顯微鏡的最大分辨率數值不會小于0.2μm，人眼的分辨力是200μm，所以一般顯微鏡設計的最大放大倍數通常為1000倍。(二)相差顯微鏡(phase-contrastmicroscope,PCM)

由P．Zernike于1932年發明，并因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經染色的標本和活細胞。利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的光程差轉變為振幅（光強度）的差別。P31在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡兩個特殊之處：1.環形光闌（annulardiaphragm）位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。2.相位板（annularphaseplate）在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ

環狀光闌裝在聚光鏡的下方，而與聚光鏡組合為一體——相襯聚光鏡。它是由大小不同的環形光闌裝在一圓盤內，外面標有10X、20X、40X、100X等字樣，與相對應倍數的物鏡配合使用。原理圖:微分干涉顯微鏡Differentialinterferencecontrastmicroscope（DIC）當兩束光通過光學系統時會發生相互干涉，如果相位相同，干涉的結果是亮度增強，反之，就會相互抵消變暗，這就是光波的干涉現象。微分干涉顯微鏡是以平面偏振光為光源，光線經棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經過樣品的相鄰部位，然后經過另一棱鏡將這兩束光匯合，從而樣品中厚度上的微小差別就會轉化成明暗區別，增加了樣品反差，造成了標本的人為三維立體感，類似大理石上的浮雕。微分干涉顯微鏡適于研究活細胞中較大的細胞器，如果接上錄像裝置可以記錄活細胞中的顆粒以及細胞器的運動。(三)熒光顯微鏡技術(Fluorescencemicroscope)

1.熒光顯微鏡的特點:①光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡

②照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上③有兩個特殊的濾光片，激發光濾片用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的阻斷濾片用于濾除紫外線，用以保護人目熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、DNA藍色）熒光標記:同一樣品可以同時用兩種以上的熒光素標記（四）、激光掃描共焦顯微境激光共聚焦掃描顯微鏡光路圖激光掃描共焦顯微鏡的特點:用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，能顯示細胞樣品的立體結構分辨率大約是普通光學顯微鏡的3倍用途類似熒光顯微鏡,但能掃描不同層次,形成立體圖像掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點LCSM照片，藍色為細胞核，綠色為微管(五)暗視野顯微鏡光路圖聚光鏡中央有擋光片，視野背景是黑的，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，物體邊緣是亮的。可觀察4~200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。(六)倒置顯微鏡倒置顯微鏡inversemicroscope物鏡與照明系統顛倒；用于觀察培養的活細胞，通常具有相差或DIC物鏡，有的還具有熒光裝置。

二、電子顯微鏡技術(electronmicroscope)（一）、透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM）

1932年Ruska發明原理:(電子顯微鏡與光學顯微鏡的成像原理基本一樣)

用電子束作光源，用電磁場作透鏡,電子束的波長與發射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短.分辨率0.2nm,放大倍數為數百萬倍.用于觀察超微結構(ultrastructure),及小于0.2μm,光鏡下無法看清的結構.光鏡與電子顯微鏡(透射電鏡)的結構3.制樣技術:1）超薄切片技術:步驟:P36電子束穿透力很弱,超薄切片厚度僅50nm左右，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。萊卡超薄切片機內質網透射電鏡圖2）負染技術用重金屬鹽(如磷鎢酸)染色；吸去染料干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸的出地方沒有染料沉積，從而出現負染效果，分辨力可達1.5nm左右。NegativeStainedArchaebacteria3）冰凍蝕刻(freeze-etching):

標本置于-100度的干冰或-196度的液氮中，進行快速冰凍。用冷刀驟然將標本斷開升溫，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結構-蝕刻向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。復膜顯示出了標本蝕刻面的形態，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。

冰凍斷裂與冰凍蝕刻技術（二）、掃描電子顯微鏡(scanningelectronmicroscope，SEM)20世紀60年代問世，用來觀察標本的表面結構.用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子的多少與電子束入射角有關，也就是說與樣品的表面結構有關，次級電子由探測體收集，并在那里被閃爍器轉變為光信號，再經光電倍增管和放大器轉變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。（三）、掃描隧道顯微鏡（scanningtunnelingmicroscope，STM）

由Binnig等1981年發明,是一種探測微觀世界物質表面形貌的儀器.根據量子力學原理中的隧道效應而設計。當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV~2V），針尖與樣品之間產生隧道效應而有電子逸出，形成隧道電流。電流強度和針尖與樣品間的距離有函數關系，當探針沿物質表面按給定高度掃描時，因樣品表面原子凹凸不平，使探針與物質表面間的距離不斷發生改變，從而引起電流不斷發生改變。將電流的這種改變圖像化即可顯示出原子水平的凹凸形態。利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質等分子的原子布陣，和某些生物結構，如生物膜、細胞壁等的原子排列。分辨率很高，橫向為0.1~0.2nm，縱向可達0.001nm優點是三態（固態、液態和氣態）物質均可進行觀察，而普通電鏡只能觀察制作好的固體標本。

第二節細胞組分的分析方法一、離心技術(一)、細胞破碎:(二）、差速離心（differentialcentrifugation）在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。差速離心只用于分離大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。通過差速離心可將細胞器初步分離

速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀（三）、密度梯度離心（densitygradientcentrifugation）：

1、速度沉降（velocitysedimentation）:用途:用于分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器特點:介質密度較低，介質的最大密度應小于被分離生物顆粒的最小密度原理:介質密度梯度十分平緩,生物顆粒（細胞或細器）按各自的沉降系數以不同的速度沉降而達到分離2、等密度沉降（isopycnicsedimentation）:用途:用于分離密度不等的顆粒特點:介質密度較高,陡度大,介質的最高密度應大于被分離組分的最大密度;所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍，故往往需要高速或超速離心原理:細胞或細胞器在連續梯度的介質中經足夠大離心力或足夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的細胞或細胞器分離

二、細胞化學（cytochemistry）技術——細胞內大分子物質的顯示方法P40福爾根(Feulgen)反應:特異顯示DNA的分布,酸水解-與希夫(Schiff)試劑反應-呈紅色FeulgenReactionPAS反應:顯示多糖的存在利用希夫(Schiff)試劑

糖原由D-葡萄糖的分支或直鏈組成，過碘酸是一種強氧化劑，能將葡萄糖中乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成二個游離醛基（—CHO），游離醛基與Schiff‘s試劑反應生成紫紅色產物，顏色深淺與多糖含量成正比。（二）其它顯示方法金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。格莫瑞方法（P40）Schiff反應：醛基可使Schiff試劑中的無色品紅變為紅色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。聯苯胺反應：過氧化酶分解H202。產生新生氧，后者再將無色聯苯胺氧化成聯苯胺藍，進而變成棕色化合物。脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色（深紅色）。米倫反應：氮汞試劑與蛋白質上的酪氨酸殘基反應，形成紅色沉淀，顯示蛋白質的存在。（P40）三、免疫細胞化學（immunocytochemistry）——特異蛋白抗原的定位與定性研究細胞內蛋白質分子定位的重要技術。應用免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術。(一)免疫熒光技術（immunofluorescenttechnique）P41熒光素:異硫氰酸熒光素（fluoreceinisothiocyante，FITC），為黃色、橙黃色或褐黃色結晶粉末，有兩種異構體，易溶于水和酒精等溶劑。分子量為389，最大吸收光譜為490～495，最大發射光譜為520～530urn，呈現明亮的綠色熒光，是最常用的標記抗體的熒光素。免疫酶標技術:辣根過氧化物酶(二)免疫電鏡技術免疫膠體金技術:金膠體顆粒氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用而成為穩定的膠體狀態，故稱膠體金。膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合。免疫金標記技術(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒。

四、細胞內外特異核酸序列的定位與定性——分子雜交（molecularhybridization）可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系（一）、原位雜交（insituhybridization）概念（p41)：細胞內特異核酸（DNAorRNA)序列的定性和定位。用標記的核酸探針通過分子雜交確定特意核苷酸序列在染色體上或在細胞中位置的方法。1.光鏡原位雜交：熒光素、放射性同位素2.電鏡原位雜交：生物素、金膠體顆粒

（二）、Southern雜交

原理是，具有互補核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當條件下，通過氫鍵結合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA雜交的雙鏈分子。這種技術可用來測定單鏈分子核苷酸序列間是否具有互補關系。是體外分析特異DNA序列的方法，操作時先用限制性內切酶將核DNA或線粒體DNA切成DNA片段，經凝膠電泳分離后，轉移到醋酸纖維薄膜上，再用探針雜交，通過放射自顯影，即可辨認出與探針互補的特殊核苷序列。將RNA轉移到薄膜上，用探針雜交，則稱為Northern雜交。五、定量細胞化學分析技術（一）、流式細胞儀流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發出散射光和熒光，經探測器檢測，轉換為電信號，送入計算機處理，輸出統計結果，并可根據這些性質分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flowcytometer）（二）、顯微光譜分析技術—顯微分光光度測定技術原理：利用細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜的特性，測定細胞中某些物質的含量。

DNA：含量=50A*稀釋倍數

公式中50的含義是：在標準厚度為1cm的比色杯中，OD260為1相當于50mg/mL的雙鏈DNA，40mg/mL的RNA。紫外光顯微分光光度測定法：可見光顯微分光光度測定法：第三節細胞培養與細胞工程一、細胞培養細胞培養（cellculture）:選用最佳生存條件對活細胞進行培養和研究的技術。人的（一）動物細胞培養細胞培養

1.原代細胞:2.傳代細胞:3.細胞貼壁:4.接觸抑制:5.細胞系(cellline)：原代細胞度過傳代危機又能進行傳代的細胞。有限細胞系、永生細胞系。實驗室常見的細胞系

6.轉化細胞:正常細胞在某種因子的作用下發生突變而成為具有癌性的細胞。

7.細胞克?。簭哪骋患毎抵蟹蛛x出單個細胞，由此增殖形成（通過有絲分裂）的具有相同遺傳性狀的細胞群。

8.細胞株(cellstrain):經過篩選具有特殊的遺傳標記或性質的細胞克隆。

（二）植物細胞培養1.組織培養：2.單倍體培養：3.原生質體培養:原生質體（protoplast）

植物組織培養

植物原生質體培養

(三)非細胞體系在細胞生物學研究中的作用非細胞體系(cell-freesystem):

來源于細胞，而不具有完整的細胞結構，但包含了進行正常生物學反應所需的物質（如供能系統和酶反應體系等）組成的體系即為非細胞體系。近年來，人們利用這一體系探討了許多細胞生命活動中的重要問題，如DNA復制，RNA轉錄，蛋白質合成，膜泡運輸，細胞周期調控、核膜及染色質的組裝、核質運輸機制等。二、細胞工程(cellengineering)(一)細胞融合（cellfusion）P44概念:細胞雜交（cellhybridization）同核體（homokaryon）

異核體（heterokaryon）誘導細胞融合的方法:

生物方法:

化學方法:

物理方法:細胞融合

（二）、單克隆抗體技術克隆（clone）：對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。1.血清抗體:抗原免疫系統（B淋巴細胞）抗體（混合物,抗血清)2.單克隆抗體:單個B淋巴細胞抗體（單一物質)專一性

B淋巴細胞：體外培養腫瘤細胞：體外培養雜交瘤細胞單克隆抗體

培養上清中X抗體的檢測克隆化培養單克隆雜交瘤細胞培養上清中X抗體的檢測雜交瘤細胞可持續分泌單克隆抗體規模化培養獲得大量單克隆抗體動物免疫細胞融合混合細胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細胞骨髓瘤細胞X抗原B淋巴細胞瘤的突變株培養數天后細胞死亡

無限生長細胞分泌X抗體只有雜交瘤細胞可長期存活下來BALB/c雜交瘤技術操作流程圖解接受抗原刺激后，能分泌針對該抗原的特異性抗體，在體液免疫中具有重要功能。B淋巴細胞本身是一種終末分化細胞，通常不再進行細胞分裂，存活一段時間后便會死亡——短命細胞1.B淋巴細胞