惡性腫瘤治療失敗與死亡的原因

轉移瘤細胞，通過血流、淋巴路和體腔，達到以類似于圓形腫瘤的后續組織器官的過程，稱為轉移。轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征,也是臨床絕大多數腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因,防治轉移是改善腫瘤預后的關鍵。惡性腫瘤的轉移過程復雜多變,突破基底膜的侵襲被認為是轉移的早期事件和主要特征。但不同類型的細胞轉移特性各不相同,某些類型的腫瘤極富侵襲性,容易形成繼發性轉移(如小細胞肺癌、惡性黑素瘤等);而另外一些腫瘤雖然局部侵襲性很強,但極少發生遠處轉移(如皮膚基底細胞癌、顱內惡性膠質細胞瘤等);還有一些腫瘤局部病變局限、浸潤不明顯時即可有遠處轉移(如甲狀腺濾泡型腺癌及某些軟骨肉瘤等);即便同一部位的腫瘤轉移途徑也可不同,如肺鱗癌易通過淋巴道轉移,腺癌卻易出現血道和胸膜種植性轉移。探索這些不同轉移現象的內在分子機制將有助于預測、證實和消除致死的轉移性腫瘤。1腫瘤轉移機制1.1轉移瘤的形態表現因受轉移的歷史作用DNA突變、染色體重排和表觀遺傳學改變構成了腫瘤細胞基因組的內在不穩定性。實驗證實,同一轉移性克隆中可以分離出不同惡性潛能的亞克隆,而高轉移性克隆出現遺傳學突變的頻率要遠遠高于非轉移性克隆,提示腫瘤轉移是一個主動的過程,與基因組的不穩定性具有早期聯系。細胞內在的基因組不穩定性和外部微環境適者生存的進化選擇共同作用,導致腫瘤細胞對正常內環境的生長調控、免疫監視和環境抑制產生抗性;在此基礎上發生連續突變和異常分化,形成腫瘤的異質性,通過有絲分裂在細胞間世代傳遞。腫瘤在轉移的過程中累積變異,多數轉移瘤分化更差,以至喪失其特殊結構;但少數轉移瘤反而出現更高級別的分化狀態和原發瘤中較難出現的結構,如低分化鼻咽癌的淋巴結轉移灶中出現上皮角化珠,肝癌肺轉移灶中的細胞分泌膽汁等。轉移瘤往往比原發瘤中的細胞顯示出更強的生長特性:如細胞分裂指數增高,3H-胸腺嘧啶攝取量增加等。表觀遺傳學的可適應性也是腫瘤異質性的重要來源,哺乳動物H3-K27甲基轉移酶EZH2是PcG(polycombgroup)基因家族的重要成員,Varambally等研究發現EZH2在前列腺癌轉移演進的過程中出現異位過表達,重建染色體,組成性抑制多種抑癌基因,并與腫瘤的轉移和不良預后密切相關。腫瘤的遺傳異質性是腫瘤細胞逃避免疫監視、產生化療抗性、形成轉移復發的根源,是抗轉移治療中不可忽視的重要環節。1.2常見的非隨機分布目前研究證實,在腫瘤出現轉移之前,原發瘤釋放可溶性激素受體,動員造血前體細胞先期到達特定組織,重塑細胞外基質,修飾間質細胞和生長因子生長的環境,預先建立轉移前生境,為后續的遠處定植創造條件。這些募集的造血前體細胞表達某些共同的分子特征,比來源于原發灶的散落細胞具有更強的歸巢效應和創造轉移前生境的能力。在這一過程中,腫瘤往往對特定器官表現出親嗜性而呈現定向轉移(如眼脈絡膜黑素瘤肝轉移、前列腺癌椎骨轉移)。Paget用“種子-土壤”學說來解釋這種非隨機分布:腫瘤細胞與某些組織的內皮細胞和基底膜細胞發生特異性結合,增加侵襲性,并依靠表達的受體和有關信號轉導途徑對器官特異性生長因子產生應答。Kaplan等發現在腫瘤轉移之前由原發瘤動員的表達1型血管內皮生長因子受體(vascularendothelialgrowthfactorreceptor1,VEGFR-1)的造血前體細胞能夠在轉移的預定器官聚集形成細胞團,用VEGFR-1抗體阻斷或剔除VEGFR-1陽性的造血前體細胞,能夠抑制預先遷移至器官的造血前體細胞團的形成與腫瘤的轉移。另外,Cerb-B2過表達的乳腺癌更易產生中樞神經系統的轉移,可以解釋為它們的同源配體(heregulins/neuregulins)是神經生長因子,而過表達轉錄因子c-Met的結腸癌或胰腺癌分別對肝臟中高水平的轉化生長因子-α(transforminggrowthfactor,TGF-α)或肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)產生應答而呈現嗜肝性。轉移前生境概念提出了這樣一個可能性:以VEGFR1等相關分子為靶標,在臨床具有應用價值。1.3emt在腫瘤轉移中的作用腫瘤細胞通過去分化由多邊形上皮樣形態轉變為梭形間葉性細胞形態,獲得更具運動能力的表型,這一過程稱為上皮間充質轉化(EMT)。不同組織中的上皮細胞通常具有其獨特功能,如運動、離子轉運和作為抗原提呈細胞參與免疫反應等。當受到外界刺激時,上皮細胞的表型特征可發生不同程度的改變而呈現間充質細胞的特點,如形態扁平、細胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白)表達減少、角蛋白細胞骨架轉化為波形蛋白為主的細胞骨架等。這種表型的轉換降低了腫瘤細胞之間的同型黏附,引起細胞骨架重排,改變細胞極性,使之具有穿越基底膜游走至間質或遠端其他組織的能力,此外還可使細胞獲得凋亡抗性而實現轉移的持續性。建立新的生境后,腫瘤細胞可能又通過EMT恢復非轉移表型。EMT可以由許多不同的刺激信號所介導,其中最重要的是TGF-β信號,其他重要的調節因素包括有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAP)、E-cadherin丟失(或轉化為N-cadherin)和轉錄因子Twist與Snail(SNA1)的激活。Wnt、Notch、Hedgehog和骨形態發生蛋白(bonemorphogenicprotein,BMP)等相關信號轉導通路也與EMT有關。雖然EMT在腫瘤轉移中的作用已經得到了廣泛認可,在實驗動物模型中得到證實并可重復,但目前仍有爭議。必須明確說明:EMT不能等同于侵襲轉移,事實上某些情況下的轉移過程并不伴隨EMT,且細胞表型的變化易受外界環境的影響。1.4失巢凋亡和凋亡是個體的抗寒性實驗和功能產物細胞的趨化性與趨觸性遷移皆依賴于細胞外基質,細胞外基質可以控制細胞遷移的速度與方向。真核細胞,除成熟血細胞外,大多須黏附于特定細胞外基質上才能抑制凋亡而存活,稱為錨著依賴性(anchoragedependence);而上皮細胞及內皮細胞一旦脫離了細胞外基質則會發生程序性死亡,這種因細胞與胞外基質之間失去交互作用而誘導的凋亡形式稱為失巢凋亡(anoikis,agreekwordmeaning“homelessness”)。這一過程體現的是一種胞核機制,避免無賴細胞(roguecells)在正確解剖位置以外的地方建立克隆。因此,轉移細胞必須對失巢凋亡以及凋亡本身產生抗性,以使自身在播散和異位定植的過程中得以存活。有研究顯示,腫瘤細胞中多種有效的抗凋亡基因(如BCL-2,BCL-XL)出現異位過表達,使它們對死亡刺激信號產生高度抗性,且往往伴隨survivin途徑的激活、基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)的上調、局部黏著斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)的過表達以及p53的失活,從而增加了轉移效率。失巢凋亡抗性在轉移過程中扮演重要角色,有關失巢凋亡抑制子的功能性篩查證實,腦源性神經營養因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)及其特異性受體酪氨酸激酶B(tyrosinekinaseB,TrkB)可以誘導腫瘤細胞形成較大團塊,在懸浮狀態下存活增殖。小鼠的腸上皮細胞對分離誘導的失巢凋亡十分敏感,且為非致瘤性,但當轉染了TrkB后,它們便具備了強烈的致癌效應和促存活功能(pro-survivalfunction),浸潤淋巴、血液系統并轉移至遠隔器官,甚至產生骨破壞。TrkB在人類多種惡性腫瘤中呈過表達,在結腸癌中出現突變,其激活可以通過乏氧誘導因子-1α(hypoxiainduciblefactor-1α,HIF-1α)誘導VEGF的表達,對繼發部位的定植和血管生成起到了潛在的輔助作用。1.5調節作用腫瘤細胞在腫瘤的腫塊血管化形成之前,其生長和進展是局限的。腫瘤的血管化作用可以通過以下途徑實現:(1)新生血管生成;(2)現存血管征用;(3)血管生成擬態(某些具有上皮、間葉雙向分化潛能的腫瘤中存在的一種沒有血管內皮細胞參與的供血模式,腫瘤細胞通過自身變形與細胞外多種成分相互作用,模仿血管壁結構,形成輸送血液的管道系統,建立特殊的腫瘤微循環,并可與原有的血管相連通,使腫瘤獲得血液)。新形成的毛細血管通透性強,易于滲漏,往往成為腫瘤細胞播散的導管。新近證實,低氧狀態可以通過賴氨酰氧化酶(lysyloxidase,LOX)誘導腫瘤進展相關基因,募集巨嗜細胞和其他炎性細胞,通過增加氧和氮的活性形式,造成腫瘤細胞基因組的不穩定性和凋亡抗性,影響腫瘤細胞的運動、侵襲和轉移。研究認為,LOX可以調控FAK、細胞基質黏附、細胞運動性,為轉移性生長創造合適的生境,在乳腺癌、口腔癌等多種類型腫瘤中與不良預后密切相關。在人類實體瘤中,淋巴結的轉移狀態被認為是最重要的臨床預后指標,實驗證實促淋巴管生成相關因子(VEGF-C和VEGF-D)可以激活淋巴管生成,介導特異性的淋巴結轉移。在動物模型中對其干預可以控制淋巴道轉移,而是否可以通過基因表達標簽預測淋巴道的轉移傾向需要進一步的研究結果來證實。2腫瘤轉移策略2.1克隆技術的發展和應用2005年ASCO年會即提出“臨床腫瘤已經進入分子腫瘤學時代”,針對腫瘤的策略實現了從“尋找和破壞腫瘤(seekanddestroy)”到“靶向和控制腫瘤(targetandcontrol)”的轉變。轉移性腫瘤治療上的經典手段包括放、化療,這些措施針對的是失控性增殖的癌細胞,抑制DNA的復制、損傷修復和細胞周期。隨著現有技術的不斷發展,通過各種基因差異顯示及克隆技術,獲得了許多侵襲轉移相關基因和有待證實的候選基因。針對致瘤信號轉導通路和激酶的小分子抑制劑、單抗與化療等其他手段結合取得了令人鼓舞的療效。研發針對腫瘤惡性生物學行為的靶向藥物是下一階段的重點。目前認為,抗血管生成藥物與細胞毒性藥物結合在膠質瘤的異體移植物模型中可以降低腫瘤中的腫瘤干細胞樣成分,提示通過周密的治療方案可以控制這一轉移復發的重要根源。對致瘤過程中表觀遺傳學改變的逆轉成為一種新的治療策略,如針對組蛋白甲基化和乙酰化的異常研發組蛋白去乙?；苿?針對于甲基化轉移酶的DNA去甲基化藥物(如5-氮雜胞嘧啶核苷)等;在研的新型靶點包括內皮素(ET1)受體和RANKL(兩者均表達于骨轉移的過程)的拮抗劑,如atrasentan(阿曲生坦,內皮素受體拮抗藥)和denosumab。新興的分子靶點也開始著眼于淋巴管生成、失巢凋亡、腫瘤-宿主/間質交互作用、細胞運動相關通路等。靶向藥物的研發過程對實驗設計提出新的要求,加強對有關靶點的生物學信息認識,制定恰當的療效評價標準,在此基礎上尋找高選擇性、高親和性以及高生物利用度的分子靶標是下一步研發的目標(表1)。2.2腫瘤胞膜轉導通路早在1875年Cohnheim就提出:干細胞的某些特殊群落與腫瘤原發灶與轉移瘤的產生均有關聯,且這些細胞對標準方案的治療具有內在抗性。這一假說被后續實驗不斷探尋論證。對于許多發生腫瘤的組織而言,自我更新是必要的(如消化道、皮膚、骨髓),在這些組織中一小部分干細胞通過不對稱分裂產生子代細胞,經過數次增殖之后才能實現終末分化,且只有極少數的干細胞能夠長期存活。也許干細胞正是通過這種方式限制遺傳性累積損傷,而當分化和死亡受到抑制時,腫瘤隨之發生。干細胞分裂所產生的子代細胞在許多腫瘤中可以為遺傳異質性提供證據,可以解釋藥物敏感性和轉移潛能的不同。傳統細胞毒性藥物能夠殺死增殖的子代細胞(減少腫瘤負荷,即一級細胞動力學的對數殺滅),但無法鏟除干細胞寄居的區室,只有極少數病例能夠通過后續的免疫重建實現臨床治愈。腫瘤干細胞是否來源于正常干細胞目前仍無定論,但如果假設成立,它們應當具備某些共性,如自我更新、通過不對稱分裂產生前體細胞、失巢凋亡抗性、永生化以及耐受環境或腫瘤細胞本身因細胞毒性藥物所產生的遺傳毒性。首先,作為損傷防御的一部分,正常干細胞存在胞膜轉運活性的增加,可以表達一些腫瘤中多藥耐藥基因所編碼的轉運蛋白(藥物和毒素的輸出泵);其次,干細胞具有激活的DNA修復能力和凋亡抗性,并且它們是相對休眠的狀態,極少分裂,可以為子代留下擴增的細胞群。所有這些因素都可以使腫瘤在細胞毒性藥物化療或放療后能重建腫瘤或轉移。最近,有推測遷移的腫瘤干細胞定位于腫瘤侵襲的前沿,呈現EMT和Wnt通路的激活,促進結腸癌的轉移。值得注意的是,研究發現運動的細胞是非擴增的,再次提示應該針對這些危險的細胞采用新的治療性修飾。某些腫瘤干細胞表達我們已認識的分子靶點,如乳腺癌干細胞表達EGFR,但是否表達ER和her-2仍有爭議。目前,在干細胞中證實的主要信號轉導通路在腫瘤中往往發生異常變化,但總體而言它們不是目前靶向治療的重點。潛在未發掘的靶點包括Wnt、Hedgehog、TGFβ、Notch、Snail、Bmi-1和Twist等。那么針對腫瘤干細胞治療是否會損傷正常干細胞?為了回答這個問題,我們需要在大量的研究中更準確的定義和特征化這兩大群體。最近,Krivtsov等發現慢性淋巴細胞性白血病的小鼠模型中的干細胞與正常造血干細胞存在不同,為尋找腫瘤干細胞的特異性靶點提供了初步證據。2.3外在細胞培養和顆粒藥物的應用RNAi是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機制。內源性或外源性dsRNA(double-strandedRNA,dsRNA)在細胞內被切割成21~25ntsiRNA,介導識別并靶向切割同源性靶mRNA分子,在細胞質內轉錄后水平高效、特異性的調節和關閉基因表達,并通過指導基因組表觀遺傳修飾引起轉錄水平的基因沉默,因此成為后基因組時代功能基因組學腫瘤研究中最重要的手段之一。體內體外實驗證實,以siRNA為基礎的治療可以用于敲除點突變激活的癌基因、抑制血管生成及轉移相關基因擴增、表達,對標準方案的放化療具有增敏作用。Yu等人通過小鼠實驗,發現名為let-7的miRNA在乳腺癌干細胞中表達極低,通過病毒載體,將人工合成蛋白精確導入腫瘤干細胞中,恢復let-7的表達,發現腫瘤干細胞在體外和體內的自我更新、多向分化和成瘤能力等“干細胞特性”均明顯被抑制。由此認為siRNA可成為針對乳腺癌干細胞的有效治療手段。Halder等將能夠促進卵巢癌細胞存活和轉移的局部黏著斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)轉載進脂質體,轉染3