血管緊張素的1型受體抗劑氯沙坦對博萊霉素誘導的大鼠肺纖維化的治療作用

肺纖維化是一種對人類健康有重大影響的疾病。其特點是肺泡和室質性炎癥的發病、氣泡結構的早期破壞以及細胞外基質蛋白酸鹽的積累。傳統的皮質激素和免疫抑制劑對彌漫性肺間質纖維化往往療效欠佳而且不良反應較多。研究顯示血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的1型受體(AT1)拮抗劑可干預AngⅡ誘導的轉化生長因子的表達,減少膠原合成,能夠減輕心、腎間質纖維化。但AT1受體拮抗劑對呼吸系統疾病的治療作用的研究仍不多。本實驗研究氯沙坦對博萊霉素(bleomycin,BLM)誘導的大鼠肺纖維化模型的治療作用和對轉化生長因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)及肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor,HGF)表達的影響,希望能為臨床上治療彌漫性肺間質纖維化提供新的方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1動物Wistar雄性大鼠共45只,8-12周齡,體重150-200g,購自武漢大學醫學院實驗動物中心。1.1.2tgf-試劑盒鹽酸博萊霉素(粉劑,購自日本化藥株式會社)以生理鹽水配制為濃度1g/L。羥脯氨酸、考馬斯亮藍蛋白、TGF-β與HGF試劑盒購自南京建成生物工程研究所。HPIAS-2000高清晰度彩色病理報告分析儀及計算機圖像處理系統和相關分析軟件為德國Opten公司產品。1.2方法1.2.1模型處理和灌注隨機將大鼠分為對照組、模型組及氯沙坦組,每組各15只。模型組:乙醚吸入麻醉行氣管內插管,按5mg/kg的濃度經氣管內插管注入BLM以制作肺纖維化模型。氯沙坦組:氣管內給藥同模型組,另于造模的當天開始每天灌胃給予氯沙坦10mg/kg。對照組:給藥時間和方法均同氯沙坦組,但給藥均以生理鹽水。各組分別于處理后第7,14,28天以乙醚麻醉各處死5只,分離雙肺,一側肺以4%多聚甲醛固定后制備石蠟切片供Masson染色,另一側肺組織于-90℃低溫保存,統一取出后制備2%組織勻漿。模型組在灌注后第7,14天分別死亡1只,氯沙坦組在灌注后第14天死亡1只,原因不明。后購置同種系、日齡、體重的大鼠對相應各組補充。1.2.2肺組織纖維化程度判斷1.2.2.1肺組織羥脯氨酸測定取出凍存肺組織制備為2%組織勻漿,嚴格按照說明書操作,測定肺組織羥脯氨酸濃度及組織總蛋白含量。1.2.2.2肺纖維化程度判斷:石蠟切片后行Masson染色,Masson染色法測定肺組織纖維化程度,HE×400下每組隨機選定9個視野,測定各視野肺間質寬度后行定量分析。1.2.2.3雙抗體夾心ELISA法檢測肺組織TGF-β與HGF蛋白表達制備肺的2%組織勻漿液后,嚴格按照HGF和TGF-β試劑盒說明書的步驟操作。1.2.2.4統計學處理所有數據用ˉx±sxˉ±s表示,采用SPSS12.0統計軟件進行檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1兩組患者均高于對照組p均>0.0.05模型組肺組織羥脯氨酸含量在第7,14,28天均高于對照組(P均<0.05)。氯沙坦組第14,28天低于模型組(P均<0.05),表明氯沙坦對羥脯氨酸合成有顯著的抑制作用。2.2氯沙坦組與對照組的比較表7模型組和氯沙坦組肺纖維化程度均呈進行性加重,模型組肺纖維化程度一直高于對照組(P均<0.05)。與對照組相比,氯沙坦組在第7天無顯著性差異(P>0.05),第14和28天均顯著較高(P均<0.05);與模型組相比,氯沙坦組肺纖維化程度各時間點均顯著較低(P均<0.05,見表2)。2.3tgf-蛋白水平模型組肺組織TGF-β蛋白水平在第7,14,28天均高于對照組,該組HGF蛋白水平在第7天高于對照組,而第14和28天低于對照組,氯沙坦組在第14和28天肺組織TGF-β蛋白水平均低于同期模型組,而HGF蛋白水平均高于同期模型組(P均<0.05,見表3和表4)。這表明氯沙坦在肺纖維化模型中能抑制肺組織TGF-β表達和促進HGF表達。3at1受體抗劑對肺纖維化的治療作用研究表明,腎素-血管緊張素系統激活引起AngⅡ增加,上調某些細胞因子的分泌,是組織纖維化的關鍵環節。AngⅡ有多個受體,其中AT1的激活可促進醛固酮分泌增加,TGF-β表達增強,引起膠原合成增多,最終導致纖維化,AT1也分布在肺組織中,肺組織局部的RAS激活引起AngⅡ增加,AngⅡ通過與AT1結合,導致肺纖維化。氯沙坦是一種臨床上常用的AT1受體拮抗劑,具有較高的特異性和較好的選擇性,但是目前AT1受體拮抗劑主要只用于心血管疾病及腎病,而對呼吸系統疾病作用的研究很少。我們的研究發現,氯沙坦組在各時間點肺組織膠原纖維和羥脯氨酸的含量均顯著的低于模型組,肺纖維化程度也顯著低于模型組,提示AT1受體拮抗劑對肺纖維化也有治療作用。TGF-β是參與肺纖維化中最重要的因子之一。在肺纖維化形成過程中,TGF-β主要通過誘導前膠原蛋白的產生與促進膠原蛋白的形成和沉積來促進纖維化。此外,TGF-β還能刺激未成熟成纖維細胞生長,及引起肺泡型上皮細胞的細胞外基質沉積。體外實驗證明,AngⅡ通過與人肺成纖維細胞AT1結合促進TGF-β分泌,導致成纖維細胞的增生,且AT1受體拮抗劑可阻斷此過程。我們的研究中,模型組肺組織TGF-β蛋白均較對照組高,這證明存在RAS通過TGF-β介導的致肺纖維化的通道,而氯沙坦組肺組織TGF-β蛋白在第7和14天均低于模型組,且氯沙坦組肺纖維化程度也低于模型組,這說明AT1受體拮抗劑抗肺纖維化作用的機制可能是阻斷RAS通過TGF-β介導的致肺纖維化的通道。HGF主要來自肝間質細胞,可調節細胞的生長、遷移及形態發生,參與多種器官的結構重建,起器官保護作用,是少數抑制纖維化的生長因子之一,其加速受損組織重建和抗纖維化作用的機制可能是促進膠原降解、抑制膠原合成。肺自分泌的HGF可能由纖維母細胞產生,某些致炎因子能刺激纖維母細胞分泌HGF。AngⅡ和TGF-β1是HGF的強抑制因子,且TGF-β1對局部HGF的抑制作用有量效關系。本研究中,模型組肺組織HGF蛋白在第7天升高達峰值,這可能是因為發病初期HGF受損傷因子的刺激而表達增高,HGF蛋白在第14和28天降低至正常以下,這可能是AngⅡ和TGF-β1對HGF的抑制作用所致。氯沙坦組肺組織HGF蛋白在第14和28天均顯著高于模型組,說明了氯沙坦可以阻斷AngⅡ對HGF的抑制作用,從而顯著增加大鼠肺組織中HGF的表達,發揮抗肺纖維化作用。TGF-β1對局部HGF的抑制作用