第九章發(fā)酵工程生產(chǎn)案例高永生1概述抗生素的生產(chǎn)工藝生產(chǎn)前期研究生產(chǎn)菌改良生產(chǎn)工藝過程發(fā)酵條件的控制提取和精制第一節(jié)抗生素發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)2一、概述1、什么是抗生素(antibiotics)

？由生物（微生物、植物和動(dòng)物）產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，能夠在一定濃度下有選擇地抑制或殺死其他微生物或腫瘤細(xì)胞3微生物發(fā)酵法(主要），如青霉素等化學(xué)合成法（極少數(shù)），如氯霉素、磷霉素等半合成法，如氨芐青霉素、頭孢利定等抗生素來源4

2、

分類

根據(jù)抗生素的作用范圍廣譜抗生素：氨芐青霉素等抗革蘭氏陽(yáng)性菌：青霉素等抗革蘭氏陰性菌：鏈霉素等抗真菌：制霉菌素等抗病毒：四環(huán)類抗生素等抗腫瘤：阿霉素等5根據(jù)抗生素的作用機(jī)制抑制細(xì)胞壁合成：青霉素類、頭孢霉素類等影響細(xì)胞膜功能：多烯類抗生素等抑制病原菌蛋白質(zhì)合成：四環(huán)素等抑制核酸合成：絲裂霉素C等抑制生物能作用：抗霉素等67β-內(nèi)酰胺類：青霉素類、頭孢菌素類氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素等大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、麥迪霉素等四環(huán)類抗生素：四環(huán)素、土霉素等多肽類抗生素：多粘菌素、桿菌肽等根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)8根據(jù)抗生素的生物來源放線菌產(chǎn)生的抗生素：鏈霉素、四環(huán)素等

真菌產(chǎn)生的抗生素：青霉素、頭孢霉素D等細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素：多黏菌素植物或動(dòng)物產(chǎn)生的：蒜素、魚素等9根據(jù)抗生素的合成途徑

氨基酸、肽類衍生物抗生素：青霉素、頭孢霉素類等四環(huán)素等糖類衍生物抗生素：鏈霉素糖苷類乙酸、丙酸衍生物抗生素：紅霉素等丙酸衍生物101928年，F(xiàn)leming發(fā)現(xiàn)可抑制葡萄球菌生長(zhǎng)的青霉素；1943年（二戰(zhàn)期間），病理學(xué)家Florey和化學(xué)家Chain共同努力下實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)（從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)）；青霉素的應(yīng)用使美國(guó)軍隊(duì)中肺炎患者死亡率由一戰(zhàn)期間的18％下降到二戰(zhàn)期間的1％；1945年，F(xiàn)leming、Florey,andChain被授予諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)；青霉素的研制成功，激發(fā)了抗生素的探索和研究工作如火如荼的發(fā)展，史稱“抗生素革命”。20世紀(jì)中抗生素使人類平均壽命延長(zhǎng)了15年以上。3、青霉素歷史11青霉素的故事已經(jīng)世界聞名，它提供了一個(gè)不同的科學(xué)方法，為一個(gè)共同的偉大目標(biāo)而合作的光輝榜樣。

——諾貝爾獎(jiǎng)?lì)C獎(jiǎng)致詞124、現(xiàn)狀藥物分類年增長(zhǎng)率%排名心血管81中樞神經(jīng)系統(tǒng)122營(yíng)養(yǎng)/代謝63呼吸系統(tǒng)84抗感染45世界前5名藥品銷售情況（IMSHealth提供)13國(guó)內(nèi)現(xiàn)狀抗感染藥以26.5%的市場(chǎng)份額高居醫(yī)院用藥大類中的榜首，第二名為心血管系統(tǒng)藥物占15.5％。從單個(gè)品種來看，排名前20位的品種中有11個(gè)都是抗感染藥（中國(guó)醫(yī)院用藥數(shù)據(jù)）。復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，該院每年銷售收入排序前3位的藥物均為抗生素。凡超時(shí)、超量、不對(duì)癥使用或未嚴(yán)格規(guī)范使用抗生素，都屬于抗生素濫用。14開發(fā)一種新的抗生素一般需要10年左右，而一代耐藥菌的產(chǎn)生只要2年，抗生素的研制速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)趕不上耐藥菌的繁殖速度抗生素“黃金時(shí)代”的五六十年代，全世界每年死于感染性疾病的人數(shù)約700萬，1999年上升到2000萬。主要原因是耐藥菌帶來的用藥困難。以對(duì)甲氧西林耐藥的葡萄球菌為例，80年代初，95%有效，1985年，有效率下降了20%，1992年，美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)了對(duì)萬古霉素產(chǎn)生耐藥性的葡萄球菌，醫(yī)生幾乎無藥可用。有遠(yuǎn)見的醫(yī)學(xué)界人士擔(dān)心，隨著病菌耐藥性“進(jìn)化”速度的加快，人類將又回到抗生素誕生前的黑暗歲月。抗生素耐藥性15我越來越心虛，因?yàn)槲覀兾淦鲙?kù)里的武器已經(jīng)越來越少----張永信教授

16美麗的悲哀17醫(yī)學(xué)的最高境界治未病思考18發(fā)酵工程三大要素生產(chǎn)菌種的性能發(fā)酵及提純工藝條件生產(chǎn)設(shè)備發(fā)酵工程二、抗生素的生產(chǎn)工藝19菌種的制備種子擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵工藝控制發(fā)酵液預(yù)處理代謝產(chǎn)物分離純化干燥產(chǎn)品發(fā)酵法生產(chǎn)抗生素的一般流程1、20

2．生產(chǎn)前期研究生產(chǎn)菌種的篩選生產(chǎn)菌種的改良發(fā)酵過程的優(yōu)化和比擬放大（Scale-up）21開發(fā)設(shè)計(jì)采集樣品富集培養(yǎng)純種培養(yǎng)原種斜面篩選（初篩、復(fù)篩）通過篩選的菌種/斜面性能鑒定育種出發(fā)菌菌種保藏菌種保藏機(jī)構(gòu)提供的純種斜面市場(chǎng)調(diào)研文獻(xiàn)分析生產(chǎn)菌種分離和篩選1）生產(chǎn)菌種的篩選22a)抗生素類藥物一般檢查項(xiàng)目：①鑒別試驗(yàn):用化學(xué)法、物理化學(xué)法以及生物學(xué)法來確認(rèn)是哪種抗生素;②毒性試驗(yàn):控制藥品中的毒性物質(zhì);③無菌試驗(yàn):檢查藥品中有無雜菌污染;④熱源試驗(yàn):控制藥品中的致熱物質(zhì);⑤水分測(cè)定:控制水分含量;⑥溶液澄明度檢查:檢查不溶性物質(zhì);⑦

溶液pH試驗(yàn):測(cè)定pH;⑧降壓試驗(yàn):檢查有降壓作用的雜質(zhì);⑨

效價(jià)測(cè)定:有效成分測(cè)定.23b)效價(jià)測(cè)定抗生素的效價(jià)測(cè)定方法:生物學(xué)法物理化學(xué)法目前各國(guó)藥典仍以生物學(xué)測(cè)定法為主。24生物學(xué)測(cè)定法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn):抗生素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)能力或殺菌能力作為衡量效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)①原理恰好與臨床要求一致，更能夠確定抗生素效價(jià)。②靈敏度高，需要樣品量較小;③既適用較純精制品,也適用于純度較差的產(chǎn)品;④已知或新發(fā)現(xiàn)抗生素都能應(yīng)用;⑤同一類型抗生素,不需分離可一次測(cè)定它們的總效價(jià)。①

操作步驟多，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)；②

誤差較大；③不能判斷抗生素的化學(xué)物質(zhì)和結(jié)構(gòu)25

Agardiffusionassay瓊脂培養(yǎng)基測(cè)試菌苔含藥物濾紙抑菌圈26ii)物理化學(xué)測(cè)定法抗生素的分離純化利用抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)特有的物化性質(zhì)(波譜特征）及反應(yīng)進(jìn)行核磁共振（碳譜、氫譜及其雜合譜）毛細(xì)管電泳氣相色譜高效液相色譜質(zhì)譜紅外光譜、紫外光譜27現(xiàn)代分析儀器操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、方法準(zhǔn)確;具有較高的專屬性缺點(diǎn):對(duì)于結(jié)構(gòu)相似的抗生素，測(cè)定結(jié)果往往只能代表總的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效價(jià);只有物理化學(xué)法測(cè)定結(jié)果與用生物學(xué)法測(cè)定效價(jià)相一致時(shí)，才能用于效價(jià)測(cè)定。優(yōu)點(diǎn)282）抗生素生產(chǎn)菌改良生產(chǎn)菌種改良自然選育人工誘變雜交育種基因工程原生質(zhì)體融合29人工誘變法實(shí)用而傳統(tǒng)的誘變――篩選育種技術(shù)尚在普遍使用物理誘變：紫外線、X-線、r-線、快中子、激光化學(xué)誘變：1）堿基類似物：2－氨基嘌呤、5－溴基嘧啶等；2）與堿基反應(yīng)的物質(zhì)：如亞硝基胍、亞硝酸、秋水仙素等；3）DNA分子中插入或缺失一個(gè)或幾個(gè)堿基：丫啶類物質(zhì)，丫啶氮芥衍生物等生物誘變：噬菌體、轉(zhuǎn)座子30基因工程（DNA重組技術(shù)）

克隆核酸內(nèi)切酶基因工程為核心的高新技術(shù)終將成為育種的主導(dǎo)技術(shù)31菌種擴(kuò)大培養(yǎng)原種搖瓶培養(yǎng)（一級(jí)）二級(jí)搖瓶培養(yǎng)各種培養(yǎng)基小型發(fā)酵罐模擬生產(chǎn)條件中試生產(chǎn)工業(yè)化生產(chǎn)3）發(fā)酵過程的Scale-up（比擬放大）斜面活化32Scale-up（比擬放大）modelsELGaddenJr<10

dm3優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)>200m3同樣生產(chǎn)率?控制參數(shù)?模擬33搖瓶發(fā)酵Shake-flask裝液量：~250mL間歇培養(yǎng)溫控受限制代謝碳水化合物慢常壓緩沖液控制pH在線取樣難容量減少瓶壁上結(jié)垢無需消泡攪拌受限制無法控制DO10-105L間歇和補(bǔ)料培養(yǎng)連續(xù)控制：pH，溫度需要銨鹽或氨氣2大氣壓無需緩沖液在線取樣易補(bǔ)料，容量增加生長(zhǎng)均勻一致需消泡多種攪拌控制DO:通氣，加壓攪拌罐發(fā)酵Stirredtank34菌種

→種子制備

→發(fā)酵工藝控制

→發(fā)酵液預(yù)處理→提取及精制→成品包裝3.抗生素生產(chǎn)工藝過程35Aschemeofthematerialflowinanantibioticproduction連消發(fā)酵罐緩沖罐361）發(fā)酵生產(chǎn)原料碳源:甜菜和甘蔗糖蜜葡萄糖，乳糖，淀粉乙醇，甲醇甘油麥芽糖漿，玉米糖漿綿籽油，花生油，豆油豬油油酸甲酯油脂氮源:綿籽粉玉米粉和玉米浸出液大豆粉和大豆面花生粉菜籽粉牛血，酪蛋白水解液乳清魚粉酵母酵母膏肉粉和骨粉

前體無機(jī)鹽37

培養(yǎng)基組成

比例%葡萄糖/蔗糖3.0-5.0淀粉3.0-5.0玉米浸提液3.0-5.0碳酸鈣0.5-1.0磷酸鹽0.1-0.5硫酸胺0.1-1.0尿素0.1-0.5油0.1-0.5Fermentation發(fā)酵培養(yǎng)基

組成比例%葡萄糖/蔗糖0.5-1.0淀粉0.5-5.0玉米浸提液5.0-8.0豆粉1.0-5.0磷酸鹽0.5-1.0

定期添加油1.0玉米糖漿連續(xù)加料Tankseed種子培養(yǎng)基38小型發(fā)酵罐2）發(fā)酵控制39

樣品分析pHDO糖氨類化合物磷酸鹽硫酸鹽Products前體物（PAA）污染探針：壓力液位pHTempDO消泡劑酸堿水冷卻通氣/攪拌流加碳氮工藝條件控制40Scale重量計(jì)控制添加量泵壓控制流量放大器控制器SupervisoryComputer

物料流量控制發(fā)酵過程的參數(shù)檢測(cè)和自動(dòng)控制41監(jiān)控中心42

HNONSCH3CH3HCOO-H

β-內(nèi)酰胺環(huán)RR=苯乙酰CH2-CO-三、青霉素的生長(zhǎng)工藝天然青霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)43β-內(nèi)酰胺環(huán)多種N-酰基取代青霉素441）產(chǎn)黃青霉的生長(zhǎng)階段分生孢子（1期）；菌絲繁殖、原生