紫外分光光度法快速測(cè)定水果、蔬菜中維生素c

1維生素c含量測(cè)定—前言維生素c也被稱為抗壞死藥物，是抗壞死藥物生物活性的總稱。它在人體內(nèi)不能合成,必須依靠膳食供給。維生素C不僅具有廣泛的生理功能,能防止壞血病,關(guān)節(jié)腫,促進(jìn)外傷愈合,使機(jī)體增強(qiáng)抵抗能力。而且在食品工業(yè)上常用作抗氧化劑、酸味劑及強(qiáng)化劑。因此,測(cè)定食品中維生素C的含量以評(píng)價(jià)食品品質(zhì)及食品加工過(guò)程中維生素C的變化情況具有重要的意義。維生素C純品為白色無(wú)臭結(jié)晶,熔點(diǎn)在190—192℃,易溶于水,微溶于丙酮,在乙醇中溶解度更低,不溶于油劑。結(jié)晶抗壞血酸在空氣中穩(wěn)定,但它在水溶液中易被空氣和其他氧化劑氧化,生成脫氫抗壞血酸;在堿性條件下易分解,見(jiàn)光加速分解;在弱酸條件中較穩(wěn)定。維生素C含量的測(cè)定方法很多。一般方法有2.6-二氯靛酚滴定法;2.4-二硝基苯肼比色法;熒光分光光度法;電化學(xué)法和高效液相色譜法。維生素C廣泛存在于植物組織中,新鮮的水果、蔬菜中含量較多。水果、蔬菜維生素C含量的測(cè)定依國(guó)標(biāo)GB/T6195-1986是采用2.6-二氯靛酚滴定法。根據(jù)維生素C的氧化還原性質(zhì),從樣品溶液由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色來(lái)辨別其終點(diǎn)的到達(dá)。但是多數(shù)水果、蔬菜樣品其提取液都具有一定的色澤,有的即使用硅藻土也很難脫色,因此,滴定終點(diǎn)不易辨認(rèn)。而GB/T6195-1986附錄A二甲苯-二氯靛酚比色法雖然適用于測(cè)定深色樣品還原型抗壞血酸,但由于萃取液二甲苯為有機(jī)溶劑,有很強(qiáng)的毒性,既不利于操作人員的健康,也不利于環(huán)境保護(hù),故不推薦此測(cè)試方法。紫外分光光度快速測(cè)定法是根據(jù)維生素C具有對(duì)紫外產(chǎn)生吸收和對(duì)堿不穩(wěn)定的特性,于波長(zhǎng)243nm處測(cè)定樣品溶液與堿處理樣品兩者吸光度之差,通過(guò)查校準(zhǔn)曲線,即可計(jì)算樣品中維生素C的含量。此法操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,結(jié)果令人滿意。特別適合含深色樣品的測(cè)定。2實(shí)驗(yàn)部分2.1抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液DV650單光束掃描型紫外分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼公司);AE-240電子天平(瑞士梅特勒公司);高速組織搗碎機(jī);800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)。浸提劑:2.0%(W/V)偏磷酸溶液:0.5mol/L氫氧化鈉溶液;100μg/mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。以上試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1標(biāo)準(zhǔn)系列抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的測(cè)定稱取抗壞血酸10mg(準(zhǔn)確至0.1mg),用2%偏磷酸溶解,小心轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中,并加偏磷酸稀釋到刻度,混勻,此抗壞血酸溶液的濃度為100μg/mL。吸取0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20mL抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,置于10mL比色管中;用2%偏磷酸定容,搖勻。此標(biāo)準(zhǔn)系列抗壞血酸的濃度分別為0.00、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.0、12.0μg/mL。以蒸餾水為參比,在波長(zhǎng)243nm處,用1cm石英皿測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列抗壞血酸溶液的吸光度。抗壞血酸吸光度為A,試劑空白吸光度為A0,計(jì)算吸光度差ΔA=A-A0的值。以吸光度差值ΔA對(duì)抗壞血酸濃度C繪制校準(zhǔn)曲線。2.2.2離心消除法樣液的制備:將水果、蔬菜樣品洗凈、擦干,稱取具有代表性樣品的可食部分100g,放入組織搗碎機(jī)中,加入100mL浸提劑,迅速搗成勻漿。稱取10—50g漿狀樣品,用浸提劑將樣品移入100mL容量瓶中,并稀釋至刻度,搖勻。若提取液澄清透明,則可直接取樣測(cè)定,若有渾濁現(xiàn)象,可通過(guò)離心來(lái)消除。樣液的測(cè)定:準(zhǔn)確移取澄清透明的0.1—0.5mL提取液,置于10mL的比色管中,用2%偏磷酸稀釋至刻度后搖勻。以蒸餾水為參比,在波長(zhǎng)243nm處,用1cm石英皿測(cè)定其吸光度。待測(cè)堿處理樣液的測(cè)定:分別吸取0.1—0.5mL澄清透明提取液,加入6滴0.5mol/L氫氧化鈉溶液,置于10mL比色管中混勻,在室溫放置40min后,加入2%偏磷酸稀釋至刻度后搖勻。以蒸餾水為參比,在波長(zhǎng)243nm處測(cè)定其吸光度。2.2.3維生素c含量由待測(cè)樣品與待測(cè)堿處理樣品的吸光值之差查校準(zhǔn)曲線,即可計(jì)算出樣品中維生素C的含量,也可直接以待測(cè)堿處理液為參比,測(cè)得待測(cè)液的吸光值,通過(guò)查校準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品的維生素C的含量。維生素C的含量,mg/100g=200×Cm×Vmg/100g=200×Cm×V;其中:m——樣品重量,g;200——稀釋倍數(shù);C——從校準(zhǔn)曲線上查得抗壞血酸的含量,μg/mL;V——測(cè)試時(shí)吸取提取液體積,mL。3結(jié)果與討論3.1反應(yīng)條件的選擇3.1.1紫外吸收光譜維生素C是烯醇化合物,具有—C==CC=C—基,在可見(jiàn)區(qū)無(wú)吸收,在紫外區(qū)有吸收,按實(shí)驗(yàn)方法,分別對(duì)不同濃度的維生素C與試劑空白溶液在200—400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果見(jiàn)圖1。由紫外吸收光譜圖表明,最大吸收峰在243nm。因此,選243nm作為測(cè)量波長(zhǎng)。3.1.2提取樣品維生素c由于維生素C極不穩(wěn)定,在樣品前處理過(guò)程中,防止抗壞血酸的氧化是非常重要的。可采用添加偏磷酸、草酸的方法加以解決。因?yàn)樗鼈兙芤种瓶箟难岬难趸?而起穩(wěn)定作用。但由于2%草酸在波長(zhǎng)243nm處有非常強(qiáng)的吸收,所以不能作為維生素C的提取液,而2%偏磷酸雖然在波長(zhǎng)243nm處有微弱的吸收,見(jiàn)圖1,可通過(guò)扣除其空白吸光值,便可計(jì)算出樣品維生素C的吸光值ΔA。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇2%偏磷酸作為分光光度法的溶劑。3.1.3浸提液加堿后靜置時(shí)間根據(jù)維生素C在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定,易分解的特性,經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)表明,水果、蔬菜提取液加堿后的靜置時(shí)間與浸提液取樣量有關(guān)。筆者以本測(cè)試方法最大取樣量0.5mL做實(shí)驗(yàn),加入堿液后室溫放置時(shí)間與吸光度之間的關(guān)系,結(jié)果見(jiàn)表1,可知在室溫放置35—90min,吸光度達(dá)最小值且穩(wěn)定,故選擇靜置40min。3.1.4堿液加入量的影響水果、蔬菜加堿量與提取液的取樣量有關(guān),當(dāng)提取液取樣量≤0.5mL時(shí),加入6滴(約0.3mL)0.5mol/LNaOH溶液,溶液呈堿性(pH值>10),利用維生素在堿性介質(zhì)中不穩(wěn)定特性,達(dá)到破壞維生素C的目的。若堿液加入量過(guò)大,會(huì)影響最終測(cè)定液的酸堿度,故選加入6滴0.5mol/LNaOH溶液。若取樣體積大于0.5mL時(shí),應(yīng)適當(dāng)多加堿液至溶液pH值>10,此時(shí)在室溫靜置的時(shí)間也必須延長(zhǎng)。3.2過(guò)高、曲線彎曲在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下,校準(zhǔn)曲線按本法測(cè)定,數(shù)據(jù)見(jiàn)表2,最大吸光度值最好不要超過(guò)0.8A,否則濃度過(guò)高容易造成曲線彎曲。以吸光度差值ΔA對(duì)維生素C含量作圖,得回歸方程ΔA=0.05496C+0.00651,相關(guān)系數(shù)r=0.9999,結(jié)果表明,維生素C在1.00—12.0μg/mL范圍內(nèi)吸光度ΔA與濃度C之間呈良好的線性關(guān)系,服從比耳定律,結(jié)果見(jiàn)圖2。3.3線性方程的校準(zhǔn)曲線連續(xù)測(cè)定空白吸光值10次,吸光度值見(jiàn)表3,在置信度約90%時(shí),取置信系數(shù)K=3,按上述線性方程,其校準(zhǔn)曲線斜率S=0.05496,則相對(duì)應(yīng)的分析物濃度作為方程的檢出限D(zhuǎn)·L=KSD/S=0.014(μg/mL)。3.4加標(biāo)回收試驗(yàn)為確認(rèn)分析結(jié)果的可靠性,了解試樣中有無(wú)干擾物質(zhì)存在,應(yīng)用本法對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表4,由表4可知,本方法回收率在97.9%—99.0%之間,平均回收率為98.3%,認(rèn)為共存物質(zhì)構(gòu)成干擾已消除。3.5方法的精度取2種維生素C含量不同的樣品,每種樣品平行測(cè)定5次,結(jié)果見(jiàn)表5,從測(cè)定結(jié)果可以看出,平行樣測(cè)定有較好的重現(xiàn)性。3.6不同方法測(cè)定維生素c和c含量的比較紫外分光光度法與2.6-二氯靛酚滴定法采用相同的前處理溶液,只是測(cè)試方法不同,從表6可以看出,不同方法測(cè)得維生素C的相對(duì)平均偏差均<5.0%,表明2種方法結(jié)果相吻合,且紫外分光光度法不受顏色干擾和其他還原性物質(zhì)的影響,更適合于含深色澤樣品的測(cè)定。3.7堿土金屬對(duì)維生素c的穩(wěn)定性由于水果、蔬菜中成分復(fù)雜,有些成分在紫外區(qū)243nm處也會(huì)產(chǎn)生吸收,利用維生素C在堿性溶液中具有不穩(wěn)定性,可在樣品中先加入堿液,調(diào)節(jié)溶液的pH值至堿性,破壞樣品中維生素C,用此液作為空白,來(lái)校正干擾物質(zhì)所產(chǎn)生的吸光值,此法具有較強(qiáng)的專一性。3.8u3000酸、堿和銅的吸光值測(cè)定在波長(zhǎng)為243nm,石英皿為1cm時(shí),10mL2%的偏磷酸的吸光值與6滴0.5mol/LNaOH溶液和2%偏磷酸配制成10mL溶液的吸光值,6次測(cè)定,結(jié)果吸光度恒定,說(shuō)明少量的NaOH溶液而引起溶液微弱酸堿度變化,對(duì)吸光值不影響。4加入本方法,先有產(chǎn)物的分離和鑒定(1)標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液必須現(xiàn)用現(xiàn)配。(2)要求每批測(cè)定樣品都要有校準(zhǔn)曲線。(3)在處理各種樣品時(shí),如遇到泡沫產(chǎn)生,可以加入數(shù)滴辛醇消除。(4)若樣品渾濁,則可用離心機(jī)分離。用轉(zhuǎn)速3000r/min,時(shí)間約為20—30min,至樣液澄清、透明,取上清液分析。(5)一般分析純抗壞血酸純度為99.5%以上,可不標(biāo)定。如試劑發(fā)黃,則棄去不用。或按GB/T6195-1986附錄B方法標(biāo)定后再用。5線性關(guān)系和方法檢出限本文利用維生素C具有對(duì)紫外產(chǎn)生吸