診斷分子生物學基本技術診斷分子生物學基本技術基礎知識實驗基礎診斷技術臨床應用amprΒ半乳糖苷酶N端編碼序列變性與復性（denaturationandrenaturation）變性在某些理化因素作用下，DNA分子互補堿基對之間的氫鍵斷裂，使DNA雙螺旋結構松散，變成單鏈，即變性增色效應解鏈過程中，DNA的A260增加，并與解鏈溫度有一定的關系，這重關系稱為DNA的增色效應復性變性DNA在適當的條件下，兩條互補鏈可重新恢復天然的雙螺旋構象即復性退火熱變性的DNA經緩慢冷卻即可復性，這一過程稱為退火解鏈溫度Tm(meltingtemperature)解鏈曲線在連續加熱DNA過程中，以溫度對A260的關系作圖，所得曲線稱為解鏈曲線解鏈溫度Tm在解鏈曲線中，紫外線吸收值達到達50%時的溫度為Tm。在Tm時，核酸分子內50%的雙鏈結構被打開Tm的影響因素堿基組成與G+C比例有關，G+C比例越高，Tm值越高實驗條件例如三氯醋酸存在使Tm變小，氯化鈉存在使Tm升高基因載體（genevector）概念把目的基因導入宿主細胞，使之傳代、擴增、表達的工具。特點自我復制遺傳標記插入位點種類質粒噬菌體病毒質粒（plasmid）概念存在于細菌染色體外的小型環狀雙鏈DNA分子。結構起動區（復制原點Ori）標記位點抗抗生素標記（抗氨芐青霉素ampr、抗四環素terr）β半乳糖苷酶α片段基因發動子（乳糖操縱子等）轉錄終止位點限制性內切酶位點

限制性內切酶（restrictionendonuclease)概念識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。分類三類重組技術中常用一類識別位點回文結構即核苷酸結構呈二元旋轉對稱。切口類型平端–AG▼CT-Alu-AGCT--TG▲CA--TCGA-

粘端-G▼AATTC-EcoR1-GAATTC--CTTAA▲G--CTTAAG-DNA連結酶（DNAligase）概念連接DNA鏈3`-OH末端和相鄰DNA鏈的5`-P末端，生成磷酸二酯鍵而形成完整的DNA鏈種類

T4噬菌體DNA連結酶T4噬菌體RNA連結酶大腸E.coliDNA連結酶作用連接粘端連接平端目的基因（targetgene）概念需要研究的基因叫目的基因。來源基因文庫存在于轉化菌內、由克隆載體所帶的所有基因組DNA的集合?；瘜W合成法用DNA合成儀利用化學原理合成該核苷酸序列。cDNA以mRNA為模板，利用反轉錄酶合成與mRNA互補的DNA。聚合酶鏈反應在體外利用酶促反應獲得特異序列的基因組DNA。核酸的分離與純化（theseparationandpurificationofnucleicacid）細胞的溶解因標本而異用SDS、Tritonx-100、超聲破碎等核酸的分離苯酚使蛋白質變性沉淀于有機相，而核酸保留在水相，將核酸分離核酸的提取冷乙醇或異丙醇沉淀核酸，離心回收核酸去除雜質70%的乙醇洗滌沉淀，除去處多余的鹽類核酸探針的標記（thelabellingprobeofnucleicacid）概念對已知堿基序列的單鏈核酸用示蹤物進行標記得到核酸探針示蹤物分類放射性核素類優點：靈敏度高、特異性高、不影響酶促反應。缺點：污染環境、損害人體。非放射性核素類抗原抗體免疫標記物地高辛、親和配體標記物生物素、熒光標記物FITC、電子密度標記物膠體金等。標記方法缺口平移法隨機引物法末端標記法缺口平移標記法（Thelabelmethodofnicklevelmoving）概念由DnaseⅠ在DNA雙鏈上切出隨機切口，DNA聚合酶Ⅰ沿缺口水解5`端核苷酸和3`端修復加入被標記核苷酸同時進行，切口平行推移，可均一標記DNA鏈，合成與模板互補的新鏈。優點快速、簡便、成本相對低、比活性較高、標記均一，大分子標記效果好（﹥1000bp）。缺點單鏈DNA、RNA、﹤200bp不能用該法標記。﹤隨機引物標記法(Thelabelmethodofrandomprimer)概念采用6個核苷酸的隨機引物與模板DNA結合的原理將標記物摻入到新合成的DNA片段中去，完成探針標記反應。隨機引物是指有各種可能排列組合順序的混合物，能與任何核酸序列退火雜交，并為DNA聚合酶的反應起到引物作用。方法將雙鏈DNA變性為單鏈，與隨機引物退火雜交，在含有dNTP底物的示蹤物的存在下，由Klenow片段催化下，從引物3`末端開始按5`-3`方向合成新的互補DNA鏈，即標記的DNA探針。優點具有缺口平移標記法的優點，而且能標記任何長度的DNA及RNA。末端標記法（Theend-labellingmethod）概念用核酸修飾酶對核酸片段的5`或3`末端進行部分標記，不對全長標記。分類Klenow片段末端標記法在有標記的dNTP存在下，Klenow片段可以填充雙鏈DNA凹陷的3`末端，獲得標記的DNA探針。T4DNA聚合酶置換合成標記法利用T4DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶和5`-3`核酸內切酶的作用，使3`末端凹陷，加入有標記的dNTP，獲得標記的DNA探針，用于末端為3`突出粘端和平端的情況。T4多聚核苷酸激酶標記法T4多聚核苷酸激酶可將[γ-32P]ATP的[γ-32P]轉移到DNA游離的5`-OH上，還可催化γ-32P與5`末端的磷酸基團交換，因此無論是否5`末端去磷酸均可用此法標記。分子生物學實驗診斷技術

核酸擴增技術核酸雜交技術多態性的分析核酸序列分析DNA重組技術雜交核酸技術（Thehybridizationtechniqueofnucleicacid）

核酸分子雜交在DNA復性過程中，如果把不同的DNA單鏈分子或者把DNA與RNA放在一起，只要存在堿基配對關系，就可以在不同分子間形成雜化雙鏈，這種分子現象為核酸分子雜交核酸雜交技術利用核酸堿基嚴格配對的特異性，核酸標記物的靈敏度而建立的檢測核酸結構與功能的方法。分類斑點雜交用于基因組DNA或RNA的分析Southernblot用于基因組DNA的分析Northernblot用于以知mRNA表達水平的分析原位雜交細胞內雜交，用于DNA或RNA的分析Southernblot（1）概念用轉膜法進行DNA雜交分析步驟提取消化提取基因組DNA并將其經限制性內切酶消化成片段電泳將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳變性使其成為單鏈轉膜將硝酸纖維素（nitrocellulose,NC）膜放在膠上，上面放吸水紙，利用毛細作用使膠中DNA片段轉移到NC膜上雜交此雜交膜在雜交液中與探針雜交顯影用放射自顯影顯示出雜交分子帶Southernblot

（2）重物吸水紙濾紙凝膠緩沖液Northernblot概念用轉膜法進行RNA雜交分析步驟提取總RNA的提取電泳將RNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳變性，防止發夾狀結構形成轉膜NC膜放在膠上，上面放吸水紙，利用毛細作用使膠中RNA片段轉移到NC膜上雜交此雜交膜在雜交液中與DNA探針雜交顯影用放射自顯影顯示出雜交分子帶注意所用試劑均用0.1%DEPC水配制注意所有器具均需高溫處理斑點雜交（dothybridizationtechnique）概念核酸與探針直接在NC膜上雜交的方法步驟提取提取DNA或RNA樣品點樣樣品點在NC膜上，烘烤使其固定在膜上雜交將膜、探針、雜交液封入雜交袋中，雜交顯影用放射自顯影顯示出雜交分子點原位雜交（insituhybridization）概念保持細胞形態，在細胞內進行核酸雜交步驟固定標本涂片或組織切片置微波爐中照射，固定標本雜交將探針（常用生物素標記法）復蓋在標本上，加入雜交液，雜交顯色載玻片放入緩沖液中，加入底物，顯色。攝影顯微鏡下觀察結果，攝影核酸雜交技術與基因診斷Ⅰ（ThehybridizationtechniqueofnucleicacidanddiagnosisⅠ）限制性內切酶酶譜分析法概念利用限制性內切酶和特異性DNA探針來檢測是否存在基因突變原理當待測DNA序列發生突變時會導致某些限制性內切酶位點的改變，其片段的長度與數量在電泳遷移率上會隨之改變。借此做出診斷應用檢測基因突變的位點與數量核酸雜交技術與基因診斷Ⅱ（ThehybridizationtechniqueofnucleicacidanddiagnosisⅡ）DNA限制性片段多態性分析（RELP）概念DNA多態性發生在限制性內切酶識別位點上，酶解該片段會產生長度不同的片段，此片段為遺傳標志，檢測致病基因的帶者原理在人類基因組中，平均約200對堿基可發生一對突變（稱為中性突變），中性突變導致個體間的差異，叫DNA多態性。在某家族中，致病基因與特異多態性緊密連鎖，此多態性為遺傳標志應用遺傳病的基因診斷核酸雜交技術與基因診斷Ⅲ（ThehybridizationtechniqueofnucleicacidanddiagnosisⅢ）等位基因特異寡核苷酸探針雜交概念根據已知遺傳病基因突變的核苷酸序列，人工合成寡核苷酸探針（突變與正常），分別與受檢者雜交，判斷其為突變的純合子、雜合子、新的突變類型或正常原理若受檢者只與突變探針雜交，則為突變純合子；若與兩種探針雜交，則為突變雜合子；若與正常探針雜交，則不存在該突變基因；若與兩者均不雜交，提示新的突變。聚合酶鏈反應PCR（polymerasechainreaction，PCR）概念用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區段原理以待擴增的DNA為模板，以一對與模板5`和3`末端互補的寡核苷酸片段為引屋，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制，合成新鏈，反復重復這一過程，可使目的DNA片段得到擴增。基本步驟變性95℃使模板DNA完全變性為單鏈應退火較Tm低5℃，使引物與模板DNA退火結合延伸72℃DNA聚合酶以dNTP為底物催化DNA的合成反應PCR與基因診斷（PCRandgenediagnosis）目的基因的克?。０鍨閏DNA或基因組）利用特異性引物獲得已知的目的基因利用簡并引物獲得同源性的基因片段利用隨機引物隨機克隆基因基因的體外突變可以隨機設計引物在體外進行基因的嵌合、缺失、點突變等改造DNA的微量分析病原微生物的微量檢測突變基因的篩選法醫學的鑒定DNA序列分析PCR引物的設計（ThedesignofPCRprimer）長度以擴增片段而定，一般15—30個堿基，引物越長，特異性越強堿基GC含量以45%—55%為佳，GC應隨機分布Tm值Tm值應底于延長溫度引物內和引物間不宜形成二級結構特異性特異性強，不擴增目的基因以外的DNAPCR擴增條件的設計（ThedesignofPCRextensioncondition）退火一般Tm－5℃，與目的基因長度有關，目的基因短，退火溫度可底，時間可短。退火溫度太高，有時會得不擴增產物，退火溫度太低，容易得不到產物延伸與目的基因長度有關，一般認為DNA聚合酶的聚合速度1000bp/min.時間太短，會得不到產物，時間太長，會出現Smear.擴增次數擴增次數太少，擴增量不足，擴增次數太多，提高靈敏度，易造成非特異性擴增，會出現Smear.引物引物過多，易出現雙引物聚合，電泳出現小于100bp的帶，引物過少，擴增量少。PCR技術探討（TheinvestigationofPCRtechnique）ⅠSmear現象原因酶量過多變性時間過短變性溫度過低dNTP量過少延伸時間過長循環次數過多模板量過多建議0.5U遞減變性時間5秒遞增變性溫度0.5℃遞增50um遞增10秒遞減2個循環遞減模板量20%遞減PCR技術探討（TheinvestigationofPCRtechniqueⅡ非特異性擴增原因引物濃度過高引物設計不合理酶量過多循環次數過多變性溫度過低延伸時間過短模板量過多建議0.1um遞減改變引物位置與長度0.5U遞減2個循環遞減2℃遞增10秒遞增酶量20%遞減單鏈構象多態分析技術（Theanalysistechniqueofsinglestrandconformationalpolymorphism）概念由DNA單鏈構象所決定遷移率的電泳技術原理在中性聚丙烯凝膠電泳時，DNA單鏈的遷移率除與長短有關，更取決于DNA自身折疊形成的由堿基順序決定的構象，甚至單個堿基不同，遷移率就不同，因此檢測出含有基因突變的DNA或RNA片段特點這項技術具有簡便、快速、敏感、和經濟等特點，適用于大樣本基因變異的篩查SSCP技術的應用（The