第三節(jié)目的基因的克隆三PCR法二cDNA法一鳥槍法四化學(xué)合成法基因工程或DNA重組技術(shù)三大用途的前提條件是從生物體基因組中分離克隆目的基因，目的基因獲得之后，或確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能，或建立高效表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因工程菌（細(xì)胞），或?qū)⒛康幕蛟隗w外進(jìn)行必要的結(jié)構(gòu)功能修飾，然后輸回細(xì)胞內(nèi)改良生物體的遺傳性狀，包括人體基因治療。一般來說，目的基因的克隆戰(zhàn)略分為兩大類：一類是構(gòu)建感興趣的生物個體的基因文庫，即將某生物體的全基因組分段克隆，然后建立合適的篩選模型從基因組文庫中挑出含有目的基因的重組克隆；另一類是利用PCR擴(kuò)增技術(shù)甚至化學(xué)合成法體外直接合成目的基因，然后將之克隆表達(dá)。一鳥槍法1.鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略2.鳥槍法操作的改進(jìn)3.鳥槍法克隆目的基因的局限性基因測序“鳥槍法”，也俗稱“霰彈法”。簡單地說，它有點(diǎn)類似生活中玩的拼圖游戲。拼圖游戲是將一個完整的畫面分成雜亂無章的碎塊，然后重新拼裝復(fù)原。而“鳥槍法”則是先將整個基因組打亂，切成隨機(jī)碎片，然后測定每個小片段序列，最終利用計(jì)算機(jī)對這些切片進(jìn)行排序和組裝，并確定它們在基因組中的正確位置。“鳥槍法”最初主要用于測定微生物基因組序列。近年來，美國塞萊拉公司先后利用改進(jìn)的全基因組“鳥槍法”完成了果蠅和人類基因組的測序工作，證明了它在測定大基因組上的可行性和有效性。“鳥槍法”優(yōu)點(diǎn)是速度快，簡單易行，成本較低。

1.鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略

隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離。（1）染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端。

全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控。部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。（2）與載體連接

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體。如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為（3）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞

受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞。（4）篩選含有目的基因的目的重組子

菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測法（篩選模型的建立）。

2.鳥槍法操作的改進(jìn)使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率。（1）使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA

例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0

kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接在連接前將DNA片段進(jìn)行分級分離

2.0kb1.6kb1.8kb凍融法濾紙法吸附法低融點(diǎn)凝膠法溶解法凝膠DNA片段回收技術(shù)

結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA的目的。適合于從1～4mL細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至20μg高純的質(zhì)粒DNA，用于測序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性內(nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。3.鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)二、cDNA法1.cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略2.cDNA法分離目的基因的基本程序3.cDNA法法克隆目的基因的局限性mDNA（1）cDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

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AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs1.cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略（2）cDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH①自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1自身環(huán)化形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)降解雙鏈中的單鏈，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNApoldNTPsRNaesH②置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’以切斷的mRNA為引物AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligase焦磷酸鈉存在條件下合成cDNA第一鏈dCTPTdT③引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

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pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGGAAAAAOH

3’NaOH退火KlenowdNTPs（3）雙鏈cDNA的克隆

雙鏈平頭的cDNA通常可以使用下列三種方法克隆入載體中：

平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收。

平頭兩端分別接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，這樣重組。分子可通過加熱局部變性和S1核酸酶處理回收插入片段。加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收。

2.cDNA法分離目的基因的基本程序（1）完備分離程序

提取細(xì)胞總mRNA，合成總cDNA，將之全部克隆，然后借助于合適的篩選手段找到目的重組子。篩選時，若使用的是多拷貝載體，則采用菌落原位雜交法篩選；若使用的是表達(dá)型載體，則采用菌落免疫雜交法篩選。完備分離程序適用于mRNA分子數(shù)少的目的基因的克隆，如人胰島素基因、干擾素基因、凝血因子VIII基因等。（2）特異分離程序

提取細(xì)胞總mRNA，瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目標(biāo)mRNA，由此合成雙鏈cDNA，然后進(jìn)行克隆。特異分離程序較適用于mRNA豐度極高的目的基因克隆如血紅蛋白基因等。

（3）差異分離程序

利用兩組細(xì)胞mRNA種類的差異，分離克隆差異mRNA所對應(yīng)的cDNA，因而這種程序較適用于分離克隆新基因。例如：正常的大鼠FR3T3成纖維細(xì)胞中，有些新基因是不能自發(fā)表達(dá)的，需在多瘤病毒感染之后方可轉(zhuǎn)錄。任務(wù)是要分離克隆這些新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能。差異分離程序

多瘤病毒感染的FR3T3細(xì)胞正常的FR3T3細(xì)胞總mRNA總mRNAcDNA雙鏈c