第十四節真菌及其毒素的檢驗

一真菌的形態特征真菌細胞單細胞單細胞呈園或橢園形，常見于酵母和類酵母菌，多細胞多細胞呈絲狀，交織在一起成菌絲體，常見于霉菌。1.酵母：大多數為單細胞，卵園形，園形，園栓形或檸檬形，大小和形態，隨日齡及環境條件而異，即使在純培養中，各個細胞的形狀，大小亦有差別，在酵母菌的生長過程中形成假絲酵母。假絲酵母:由成熟的細胞和未分化完的細胞連在一起，形成假菌絲，此種酵母稱假絲酵母。大多數酵母菌在適宜的培養基上，形成菌落與細菌相似，比細菌的菌落大，表面濕潤，粘稠易挑起，有些因時間長而表面皺宿，其色多為乳白色，少數呈紅色。菌的顏色、光澤、質地、表面及邊緣特征均有鑒別意義。液體培養：有的底部產生沉淀，有的均勻生長，有的在表面生長并形成菌膜或菌醭，厚薄也因種而異，有的甚至干而皺縮，菌醭的形成及特征有分類意義。酵母菌的繁殖無性繁殖：芽殖生殖：多邊出芽，兩端出芽，三邊出芽。芽裂：一端出芽。裂殖：橫分裂，如細菌。有性繁殖：由兩個有性細胞結合，結合在一起后兩個細胞間膜破裂，兩個單倍體核向一起集中，最后形成一個繁殖的細胞。2.霉菌：霉菌均由分枝或不分枝的菌絲構成，許多菌絲交織在一起形成菌絲體，菌絲在光學顯微鏡下呈管狀，2～10um比一般細菌放線菌細胞大幾倍至幾十倍，與酵母菌相似，而其菌絲又分為有隔菌絲和無隔菌絲，再就是根據其功能不同又分為營養菌絲，氣生菌絲。無隔菌絲：菌絲為長管狀，單細胞，細胞質內含多個核，其生長過程只表現為菌絲的延長和細胞核的裂殖增多，以及細胞質的增加，如毛霉，根霉，犁頭霉。有隔菌絲：為大多數的。菌絲由橫隔膜分隔成成串的多細胞，每個細胞內含有一個或多個細胞核，有些菌絲外觀看起來像多細胞，但橫隔膜上有小孔，使細胞質或細胞核，可自由流通，每個細胞功能也相同，如青、曲、白地霉。霉菌的菌絲據其功能又可分為：營養菌絲，氣生菌絲。營養菌絲（基質菌絲）就是在生長過程中，伸入到培養的基質中，為真菌提供營養的菌絲。氣生菌絲圖（繁殖菌絲）它主要是伸入到菌周的空氣環境中，它主要作用是產生孢子，產生孢子時的氣生菌絲稱繁殖菌絲。霉菌的繁殖主要是由繁殖器官產生孢子，繁殖器管是由繁殖菌絲產生的可以是單細胞，也可是多細胞，有時產生無性孢子，有時產生有性孢子，如青霉，曲霉，在生長過程中，由于生長條件的改變，有時產生有性孢子，有時產生無性孢子，但主要還是以無性孢子為主。有性孢子：子囊孢子，結合孢子，卵孢子，擔孢子。無性孢子：分生孢子，關節孢子，芽生孢子，孢子襄孢子，厚膜孢子。二、糧食中主要產毒霉菌的形態1．曲霉屬：營養菌絲是具分隔的分枝菌絲構成，無色或有明亮的顏色，一部分埋伏型，一部分氣生型，分生孢子梗（圖2）大部分無橫隔，光滑、粗糙或有麻點。曲霉的無性繁殖產生分生孢子，首先由基質菌絲分化出足細胞，足細胞形成直立分生孢子襄，向上伸出于基質表面，單生、不分枝、無隔膜，頂端膨大，形成園球形、棍棒形、橢園形頂襄，頂襄周圍密生短桿狀小梗，小梗為單層或雙層，雙層時下層為初生小梗，或梗基柱狀。上層為次生小梗，瓶狀，向外做輻射狀排列，小梗端著生成串的球狀分生孢子，分生的孢子一般呈黃色，但也有其它顏色。由頂襄，小梗，分生孢子形成頭狀體結構稱為分生孢子頭。2青霉屬青霉菌的菌絲體無色，淡色或鮮明的顏色，具有分隔、埋伏型或部分理伏型部分氣生型，氣生菌絲密毛氈狀，松絮狀或部分集結成菌絲索，埋伏菌絲或氣生菌絲產生直立的分生孢子梗（圖2），分生孢子梗單獨直立或做某種程度的集合乃至密集成為菌絲束，具橫隔、光滑或粗糙，上半端產生對稱或不對稱的掃帚狀分枝，在分枝上產生許多分枝的小梗，小梗以斷裂的方式形成孢子，在小梗的頂端著生成串的分生孢子，分生孢子為球形、橢圓形、或短柱狀，光滑或粗糙，分生孢子為蘭綠色、青灰色、灰綠色、黃褐色；菌落為蘭綠色，菌周有一圈白色的結構（絨毛狀）三真菌的培養真菌的生長對營養的要求不高，一般馬齡薯葡萄糖瓊脂、沙堡弱、花生c-d，察氏，保存菌種用察氏培養基。霉菌培養溫度22～28℃，PH6.5～6.8最適宜，但它可在PH1.7～9.3的環境中生長，一般在溫度稍高，濕度較大的環境中生長。真菌的菌落有以下三種類型：1．酵母型菌落：類似于一般菌落，菌落光滑，濕潤，柔軟致密，顯微鏡檢查可見圓形或橢圓形的生芽細胞，多見于酵母菌、隱球菌。2．絲狀菌落：菌落蔬松，呈棉絮狀，絨毛狀或粉末狀，一部分菌絲向上空生長并形成孢子，另一部分菌絲伸入培養基下層，培養基的正面和背面可顯示各種不同顏色。。3．酵母樣菌落：外觀性狀同酵母型菌落，但在菌落表面除見生芽細胞外，還有假菌絲伸入培養基中，念珠菌。四產毒霉菌的檢驗1．樣品的采取（1）患病畜禽的病變組織，無菌采取膿汁、肺、腎、肝等，置培養皿中待檢：（2）被毛、皮屑、或痂皮，用作皮膚致病性真菌采樣時，先在病灶部涂以消毒液，然后用消毒鑷子將毛連根撥出，或夾取痂皮、皮屑放入滅菌容器中待檢。（3）糧食谷物：根據糧屯、糧垛大小和類型，分層定點（一般分三層，五點）取樣，或分層隨機采取不同點的檢樣，充分混勻，取500g左右作檢驗用。（4）動物飼料：包括干草等一般飼料，發酵飼料，以及發霉的谷物，分層隨機取樣或采霉變部分，取500g做檢驗（5）動物性食品：如肉禽、乳及其制品，用滅菌工具采集可疑樣品250g左右，裝入滅菌容器中。2．樣品的處理與分離培養(1)谷物、糧食①內部真菌的分離取樣品10～20克，培養前將樣品在0.1％升汞中浸泡（玉米、麥粒1～2分鐘、米粒0.5分鐘），然后用滅菌蒸餾水沖洗3～4遍。或直接用無菌水淘洗，加水應超過樣品1～2cm，振蕩1分鐘倒去水，反復10次。后再用75％酒精浸泡1～2分鐘，脫去蠟質膜，再沖洗。用滅菌的小鑷子將上述經過處理的檢樣，胚部向下按等距離排列接種于高滲察氏瓊脂培養基平板上，接種時，必須將檢樣（糧粒）部分地種入培養基中，每個平板接種數量大粒約為5粒，小粒為10粒，每份檢樣共接種100粒，接種完畢后，置25～28℃培養一周，培養期間應注意觀察和記錄。②表面真菌的分離：將檢樣用無菌水洗滌2～3次后，按上法接種，培養和觀察即可。（2）動物飼料（干草、發霉谷物等）：將干草剪成1cm左右，放于三角瓶中，然后以無菌操作加入無菌水，使超過干草1～2cm，蓋好瓶塞，充分振蕩，將水倒靜再換水如上法振蕩反復5～6次，最后將水棄去，用小鑷子等距離接種于高滲察氏瓊脂平板上，置25～28℃，培養1周觀察并記錄之。（3）塊狀食品：用無菌小刀取食品的各個部位，分別用小鑷子將食品碎塊接種于高滲察氏瓊脂平板上或研磨稀釋后接種，置25～28℃培養1周，逐日觀察并記錄。（4）液狀（粉狀）食品：以無菌操作稱取檢樣5g（ml），放入裝有50ml滅菌蒸餾水的三角瓶中，經充分振蕩1～2分鐘，10×倍比稀釋，根據標本的污染情況，選擇2～3個適宜的稀釋度，分別吸取1ml，稀釋液于無菌平皿中，用高滲察氏瓊脂培養基作傾注培養，每個稀釋度作二個平皿，然后置于25～28℃培養1周，觀察記錄生長情況。3．顯微鏡檢查法（1）不染色壓片標本檢查法①病組織或膿汁：取潔凈玻片數片，于每片滴加生理鹽水一滴，然后用白金耳蘸取檢樣，混于生理鹽水中，蓋上蓋玻片即可直接鏡檢。②被毛、皮屑、角質：將檢樣置于載玻片上，滴加10％苛性鉀液1～2滴，蓋上蓋玻片，靜置5～10分鐘，再將此玻片在酒精燈上微微加溫，輕壓蓋玻片將毛屑等物壓扁而透明時即可鏡檢。③塊狀食品、谷物或草料：于潔凈載玻片上預先滴加生理鹽水一滴，再用小刀或分離針刮取霉變部一小部分，輕輕混于鹽水中，使其擴散，蓋上蓋玻片，即可鏡檢。④培養物：用組織分離針取下菌落一小部分移于預先滴加有生理鹽水的載玻片上，任其輕輕擴散，蓋上蓋玻片后即可鏡檢。（2）染色檢查法一乳酸酚棉蘭法染色液：石炭酸10g乳酸10g甘油20ml棉蘭0.025g蒸餾水10ml。制片方法：用毛細吸管吸取一小滴上述染液于潔凈的載玻片上，再用組織分離針從菌落上挑取少量培養物輕輕的放在液滴中，然后慢慢地蓋上蓋玻片，盡量避免出現氣泡，放置10～15分鐘后鏡檢。4．培養檢查法：（1）試管培養：將培養材料接種在瓊脂斜面上，于25～26℃下培養。（2）培養皿培養：將培養材料接種于瓊脂平板上，由于培養面積大，適于觀察菌落全貌，但要注意保持培養環境有一定濕度，防止培養基干裂，影響真菌生長。（3）小培養（即玻片培養法）本法適應于觀察真菌的生長狀況及其形態構造，是用一特制的金屬環放在載玻片上，加上蓋玻片即成，金屬環內經約為15mm，高約為2mm，金屬環成U型，接種前，將金屬環連同蓋玻片，載玻片一起包好，進行干熱或高壓滅菌備用，小培養法：①取經過滅菌的金屬環，浸于已經熔化好的滅菌石蠟中，然后取出放在滅菌的載玻片上，并在環上加上已滅菌的蓋玻片。②在酒精燈上微微加溫，待涼后，載玻片，金屬環和蓋玻片即粘合在一起。③將玻片測立，用毛細吸管取熔化了的真菌瓊脂培養基，從環的缺口處注入金屬環底部，其量以不超過環的下半部為度。④待瓊脂凝固后，即可用接種針挑取真菌純培養物少許，從環的缺口刺入培養基內。⑤放25～28℃逐日觀察。5．真菌的鑒定（1）顯微鏡檢：①菌絲：氣生、營養菌絲的寬度，橫隔有無、色澤，特殊菌絲器官，如假根足細胞、結節、隆起等特征。②成熟的子實器官：孢子襄、子襄果、分生孢子梗、菌絲體、分生孢子盤等的特征，顏色、形狀、大小和著生方式。③孢子：無性：孢子襄、分生、芽生、關節、厚膜孢子等。有性：接合孢子、卵、擔、子襄孢子等。（2）培養特性的鑒定青、曲、一察氏培養基，鐮刀菌、芽枝霉一馬鈴薯葡萄糖瓊脂進行劃線或點種于瓊脂上，25～28℃，定期觀察。①生長速度：培養一定天數（5、10、15天）測大小，描述常以極慢、慢、中等、快、說明。②菌的顏色：包括子實體，氣生菌絲、菌核，埋伏菌絲及其顏色。③菌落表面構造：蔬松，緊密、扁平、隆起，凹陷，或皺褶，有無同心環，放射溝，并觀察菌全部，中心部，中間部分及邊緣部分。④菌落質地：外觀似氈狀、絨毛狀、棉絮狀、羊毛狀、襄狀、粉粒狀、明膠狀或皮革狀。⑤