核酸分子雜交技術

NucleicAcidMolecularHybridization主講內容核酸分子雜交的基本原理核酸探針核酸分子雜交技術一、DNA的變性（denaturation）變性：在一定的條件下，DNA雙螺旋之間的氫鍵斷裂，解離成兩條無規則的卷曲狀單鏈DNA分子，此現象稱為變性。復性：去除變性因素后，單鏈DNA通過堿基互補配對原則重新結合成穩定的雙螺旋結構，這一過程稱為復性。二、DNA的復性(renaturation)退火淬火

根據核酸變性和復性的原理，來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補配對形成異源雙鏈雜交體的過程。三、核酸分子雜交雜交的基礎：核酸分子單鏈之間的堿基互補配對。注：分子雜交可以在DNA與DNA、RNA與RNA、RNA與DNA的兩條單鏈之間進行。

核酸分子的濃度溫度離子強度核酸分子的復雜性

影響核酸分子雜交的因素四、核酸分子雜交技術

通過標記的單鏈核酸探針與固相支持物上或液相中單鏈的互補靶序列退火形成雙鏈雜交體，而定性或定量檢測特異DNA或RNA的技術。

第二節核酸探針

核酸探針的概念

核酸探針的類型

核酸探針的標記

核酸探針的檢測方法

核酸探針(nucleicprobe)：指能夠與待測的靶核酸片段互補結合的帶有特殊可檢測標記的核苷酸片段。一、概念按化學本質分：DNA探針

RNA探針按標記物分：放射性標記探針非放射性標記探針按分子大小分：寡核苷酸探針單鏈探針雙鏈探針二、核酸探針的類型二、常見核酸探針1.基因組DNA探針

2.cDNA探針

3.RNA探針4.寡核苷酸探針來源于某種生物的基因組，為某一基因的全部或部分序列。來源于cDNA,不含有內含子序列，適用于基因表達研究。大多以單鏈形式存在,雜交效率高。可通過體外轉錄技術獲得。用化學合成技術在體外合成的單鏈DNA,長度一般為20-50bp。三、核酸探針的標記

1.核酸探針的標記物（1）放射性核素標記物常用放射性核素標記物有：32P、35S、3H優點：①靈敏度極高,可檢測到10-14～10-18g的物質，在最適條件下，可以測出樣品中少于1000個分子的核酸含量，光譜分析法只能鑒定10-9g的物質。②對堿基配對的特異性和穩定性無影響。③特異性高。缺點：放射性污染，有半衰期。32P或35S同位素標記的單核苷酸（α）（γ）（OH）HOH(2)非放射性標記物優點：無放射性污染，穩定性好，可以較長時間存放，處理方便。缺點：靈敏度、特異性不夠理想。常用非放射性標記物有：生物素、地高辛、酶、熒光素2.核酸探針的標記方法（一）酶促法缺口平移法隨機引物法DNA探針末端標記法（二）化學法預先標記酶促反應轉移探針（1）缺口平移法（nicktranslation）

由DNA酶Ⅰ和大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。酶促法隨機引物：含有各種可能排列順序的六核苷酸片段的混合物。（2）隨機引物法（randompriming）酶促法

在5’或3’端通過酶促反應加上標記物DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端標記法T4多核苷酸激酶5’末端標記法聚合酶鏈反應標記DNA探針RNA探針的標記寡核苷酸鏈探針的標記（3）探針的末端標記酶促法Ⅰ

DNA聚合酶ⅠKlenow片段3’末端標記法限制性內切酶酶促法ⅡT4多核苷酸激酶5’末端標記法ATPADPγ32PT4多核苷酸激酶堿性磷酸酶酶促法1.生物素地高辛標記核酸探針2.酶、熒光素標記核酸探針化學法生物素化核苷酸①生物素(biotin)標記生物素-16-dUTP

光敏生物素標記法強光10-20分鐘

光敏生物素的結構②

地高辛(digoxigenin)標記Dig-11-dUTP的結構③

酶標記堿性磷酸酶辣根過氧化物酶④熒光素標記異硫氰酸熒光素（FITC）熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架結合四、核酸探針的檢測

核酸分子雜交反應完成后，必須使已標記的核酸探針顯示出可檢測信號，方能檢測未知的待測核酸序列。

1.放射性同位素標記探針的檢測

2.非放射性標記探針的檢測1.放射性同位素標記探針的檢測（1）放射自顯影：利用放射線在X線底片的成影作用來檢測雜交信號。（2）液體閃爍計數器：2.非放射性標記探針的檢測（1）直接檢測：雜交反應后可以立刻觀測結果。如酶和熒光素直接標記的探針。（2）間接檢測：反應結果不