白花丹參總丹參酮對血栓閉塞性脈管炎大鼠模型的治療作用

動脈硬化性血栓形成（tho）是一種特定的非動脈硬化性疾病，主要影響小腿骨和周圍血管，主要影響下肢中的小動脈和靜脈。其臨床特點為患肢皮膚發涼、間歇性跛行,嚴重者有肢端潰瘍或壞死,是我國慢性周圍血管病中較常見的病種。白花丹參(SalviamiltiorrhizaBungef.alba)是唇形科植物丹參的變型,主產于山東,根入藥。除具有丹參的作用和用途外,臨床發現白花丹參對治療TAO具有獨特療效,為了探討白花丹參治療TAO的有效物質及其機理,本文從體征、病理變化及血清中TXB2、6-K-PGF1α、ET等方面觀察了白花丹參總丹參酮對TAO大鼠模型的影響。1材料表面1.1實驗動物Wistar雄性大白鼠60只,體質量280～300g,由山東大學實驗動物中心提供。1.2化學試劑及試劑白花丹參總丹參酮提取物(由本實驗室制備)、LCMS-2020色譜儀(島津公司)、乙腈(色譜純)、冰乙酸(分析純)、通塞脈片(江蘇南星藥業有限責任公司),批號:Z32020535、月桂酸(國藥集團化學試劑有限公司),批號:F200909284;血栓素B2、6-酮-前列腺素F1α、ET酶免試劑盒(RD公司),批號:20110501A。1.3高效液相色譜法取白花丹參總丹參酮提取物約5mg,精密稱定,置5mL容量瓶中,甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過即得。參照文獻采用AgilentEclipseXDB-C18柱(250mm×4.6mmi.d,5μm)色譜柱;以乙腈為流動相A相,以0.1%乙酸水溶液為流動相B。線性梯度洗脫時間程序為0min,20%A;20min,60%A;50min,80%A;流速0.8mL/min;UV檢測波長270nm;進樣量10μL。2方法2.1模型制備和給藥60只大鼠隨機為假手術組(6只)、模型組(10只)、通塞脈片陽性對照組(10只)、白花丹參高劑量組(11只)、中劑量組(12只)和低劑量組(11只)。參照文獻方法稍加改進,制作TAO模型:將大鼠用10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉,右下肢股內側剪毛。酒精皮膚消毒,縱行切開約1.5cm切口,游離股動脈,用動脈夾阻斷血流,假手術組于動脈夾下方遠心端注入0.2mL生理鹽水,其余大鼠注入0.2mL月桂酸。各組均于注射月桂酸后15min去掉動脈夾,縫合皮膚,觀察結果。各組均于手術前灌胃給藥,通塞脈片對照組給通塞脈片0.66g/kg,高劑量組給白花丹參總丹參酮提取物40g/kg(相當于生藥濃度),中劑量組給白花丹參總丹參酮提取物20g/kg,低劑量組給白花丹參總丹參酮提取物10g/kg。假手術組和模型組均給予等容量羧甲基纖維素鈉溶液,1次/d,連續1w。2.2疾行狀況分級標準大體觀察大鼠患肢皮膚顏色、溫度、患肢有無腫脹、有無壞疽及壞疽的程度、跛行狀況。參照王軍等采用的分級標準分級,Ⅰ級:病變局限于趾甲部;Ⅱ級:病變局限于趾部;Ⅲ級:病變局限于足爪部;Ⅴ級:病變局限于膝關節以下;V級:病變發展到膝關節以上。2.3纖維組織病理學觀察全部送檢的截肢標本解剖出月桂酸注射處以下部位的動脈、靜脈主干,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片、常規HE染色,觀察血管平滑肌、纖維組織病變情況。同時分別對動脈壁炎性細胞浸潤、纖維增生等情況進行觀察。2.4血漿txb2、6-k-pgf1、et試驗采用酶聯免疫法測定,具體步驟參照說明書。2.5統計處理實驗數據用xˉ±sxˉ±s表示,計數等級資料采用秩和檢驗,計量資料采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析處理。3結果3.1紫外吸收色譜圖/UV/MS圖譜獲取按“1.3”項下色譜條件,對白花丹參總丹參酮的主要成分進行分析,所得到紫外吸收色譜圖(圖1-A)與總離子流色譜圖(圖1-B)基本吻合。應用ESI-MS技術,對總離子流色譜圖中的各色譜峰經質譜掃描后得到一級質譜圖,按各色譜峰的質譜圖與文獻核對,對相應的化合物進行了結構推測,結果見表1。3.2肢體長期造模肢體勞動大鼠經股動脈注入月桂酸造模后,各鼠患肢皮膚溫度降低,約5min后足爪部開始出現不同程度的蒼白,腫脹。次日造模成功的大鼠均出現造模肢體缺血表現、跛行或拖曳現象、肢體青紫顏色加深并逐漸向上發展。一周內有部分大鼠出現肢端糜爛、潰瘍及炎癥反應,有膿液滲出,惡臭味,少數大鼠出現患側壞疽部分脫落,患肢的脛后肌群出現嚴重壞死。模型組的病變最嚴重,通塞脈片組與中、高劑量給藥組的病變最輕,與模型組比較有顯著性差異(P<0.05),低劑量組與模型組比較沒有顯著性差異,見表2。3.3血栓形成的組織假手術組股動脈均呈通暢狀態,內膜光滑完整,無剝離和脫落現象,血管內無血栓形成,無炎性細胞浸潤;TAO模型大鼠股動脈內均有不同程度的血栓形成。對于模型組,在低倍鏡下觀察,表現為動脈壁增厚,動脈管腔內發生血栓性閉塞,未見再通,內膜大部分脫落,外膜炎性細胞浸潤較其他組別明顯,伴行靜脈內亦有血栓形成;在高倍鏡下觀察,內皮細胞部分發生水腫、變性、壞死或脫失。通塞脈片組與中、高劑量給藥組的血栓范圍均減少,管腔較規則,血管及周圍組織少量炎性細胞的浸潤,炎癥反應減輕。低劑量組動脈壁增厚,炎性細胞浸潤及血栓形成較嚴重,效果不明顯。見圖2。3.4各組大鼠血清中6-k-pgf1、txb2、et的含量比較與假手術組比較,模型組血清中6-K-PGF1α含量降低,TXB2、ET顯著升高(P<0.05);與模型組相比,通塞脈片組及白花丹參總丹參酮高、中劑量組6-K-PGF1α含量顯著升高,TXB2、ET含量與模型組降低(P<0.05)。低劑量組TXB2含量顯著降低(P<0.05),但6-K-PGF1α及ET的含量改變不明顯。見表3。4丹參酮a、txb2、et目前,TAO的發病機制尚未完全闡明,但血管內皮細胞(VascularEndothelialCell,VEC)功能受損是其重要的一個方面。內皮素ET、血栓素TXA2及前列環素PGI2等是由VEC直接合成分泌或經VEC轉化的生物活性物質,這些物質與血栓的形成密切相關。丹參酮對心血管系統具有廣泛的作用,主要表現為對血管內皮細胞的保護作用。體內外實驗證明,丹參酮具有抑制炎癥的作用,這種作用可能與丹參酮抑制炎癥細胞內細胞因子的產生有關,同時與抑制花生四烯酸的代謝也有關系。丹參酮ⅡA可降低全血血小板粘附分子CD41和CD62P的表達,從而起到抗血栓形成和血小板聚集的作用。本實驗研究發現造模后均有不同程度的血栓形成,TXB2、ET含量顯著升高,6-K-PGF1α含量降低。TXA2、PGI2系統的失衡及ET含量的升高加重和促進了TAO的形成和發展,這些因子既反應血小板的聚集情況,更可反應血管內皮的抗血栓功能。造模大鼠經白花丹參總丹參酮治療后,