含eui1的協(xié)青早保持系ga1和aba對水稻上部間隔伸展的影響

eiu長穗基因是一個隱藏的單胞菌，可以嚴重擴展水稻的頂部。在大大提高水稻抗青之前，我們發(fā)現(xiàn)了具有相同和不同位置的eiu基因。eiu基因可以顯著擴展水稻的頂部，其頂部比對照組長得多倍（表1）。當(dāng)水稻育種家將eiu轉(zhuǎn)移到稻田育種生殖系時，eiu基因幾乎“模擬”了赤霉素外源性的作用，并顯著延長了水稻育種系的穗段（即母種）。原則上，它消除了普遍存在的小穗系水稻不良系統(tǒng)中不能完全提取的缺點，建立了“混合水稻育種技術(shù)”。研究長穗頸部不育生產(chǎn)區(qū)的生理機制，對指導(dǎo)和指導(dǎo)長穗頸部不育生產(chǎn)區(qū)的種子生產(chǎn)技術(shù)和這種水稻育種，為u型基因的形成提供理論依據(jù)。有關(guān)eui水稻節(jié)間伸長的機制,何祖華等采用近等基因系報導(dǎo)了不同生育期株高基因(即長穗頸基因eui1、半矮稈基因sd1、超矮基因sds(t)、顯性矮稈基因D53等)對GA3的敏感性及對內(nèi)源激素含量的調(diào)節(jié).其結(jié)果表明,株高基因?qū)?種內(nèi)源激素(GAs、IAA、ZRs、ABA)都有一定的調(diào)節(jié)作用,通過對內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)而達到對植株性狀的控制;首次發(fā)現(xiàn)高稈的eui1基因型含高水平的GAs、對外源GAs較敏感等等.前人對玉米、水稻、豌豆等十幾個植物種矮化突變品系的試驗研究表明,GA1是植物體內(nèi)刺激莖伸長至關(guān)重要的GA活性形式[6～8].對深水稻的研究結(jié)果顯示,深水稻上部節(jié)間的生長速率取決于內(nèi)源的生長,促進物質(zhì)GA1和生長抑制物質(zhì)ABA的比值.受上述研究啟示,本研究即以含有長穗頸基因eui1、eui2和野生型Eui的3個等基因系為材料,通過供試植株在不同生育期、不同器官組織的GA1、ABA含量測定及噴施GA合成抑制劑,并輔之器官刪除試驗等方法,探索長穗頸水稻上部節(jié)間伸長的生理機制以及eui1、eui2控制節(jié)間伸長的表達存在差異的原因.1材料和方法1.1水稻黨組織等基因系供試材料是水稻(OryzasativaL.)秈型雜交稻同一保持系協(xié)青早遺傳背景的3個分別帶有eui1、eui2和野生型基因Eui的等基因系(表1).其中,eui1水稻的最上節(jié)間和第2節(jié)間均顯著高于Eui水稻,而eui2水稻僅最上節(jié)間顯著高于Eui水稻.A系為野敗型細胞質(zhì)雄性不育系,B系為相應(yīng)的保持系.1.2方法1.2.1樣品處理和內(nèi)源激素的提取取樣:2000年9月,在水稻幼穗分化第4期、幼穗分化第7期、抽穗始期對協(xié)青早B系3個等基因系的幼嫩節(jié)間(幼穗分化4期取第3節(jié)間,幼穗分化7期取第2節(jié)間,抽穗始期取最上節(jié)間)、劍葉和幼穗取樣,每樣品設(shè)2個重復(fù).準確稱重后置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?選幼穗分化4期、幼穗分化7期、抽穗始期取樣,是因為根據(jù)本研究觀察,這3個生育期基本處在第3節(jié)間、第2節(jié)間、第1節(jié)間即將迅速伸長的關(guān)鍵時期.內(nèi)源激素的提取、測定:根據(jù)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)激素組所編的“ELISA試劑盒說明書”所提供的方法(參見文獻),用冰冷的80%甲醇提取內(nèi)源激素,過C18柱以純化激素提取液,用于酶聯(lián)免疫測定.測GA1所用抗體為抗GA1的單克隆抗體;測定ABA采用抗(+)ABA的單克隆抗體.聚苯乙烯酶標板規(guī)格為12×8=96孔,酶標儀為DG-3022型.1.2.2ga合成抑制劑的生長2000年7月下旬,對每個供試品系作田間處理,只保留生育期為幼穗分化8期的莖蘗,其余的莖蘗剪去不用.將含99%有效劑量的GA合成抑制劑S3307用少許乙醇溶解,配成濃度分別為0、4、32、64mg/kg的溶液,于傍晚分別噴施到協(xié)青早XeB1、XeB2、XB這3個品系的植株上(主要在劍葉、劍葉鞘、倒2葉片上),至有液滴形成,每處理噴施250mL.于成熟期(8月中旬)對各處理每一品系量測24株莖蘗的株高.1.2.3刪除稻株某一器官2000年9月,于幼穗分化8期時,對協(xié)青早保持系的3個品系施加了刪除稻株某一器官的6種處理:刪除劍葉;刪除劍葉+葉鞘;刪除第2葉;刪除第2葉+葉鞘;刪除幼穗(留基部5個枝梗確保植株成活);對照.成熟期測量最上節(jié)間的長度,每處理5～10株莖蘗.2結(jié)果與分析2.1內(nèi)源素的測定2.1.1幼穗、劍葉和幼穗-劍葉中g(shù)a1含量的變化在抽穗始期,即在水稻最上節(jié)間即將劇烈伸長的時期,eui水稻穗子里的GA1含量急劇增加(圖1,左).其中,含有eui1的保持系XeB1的GA1含量高達5957.2pmol/g(FW),約為對照XB的16倍;含有eui2的XeB2的GA1水平達1001.2pmol/g(FW),約為對照的2.7倍,均達顯著水平.長穗頸水稻的劍葉也表現(xiàn)出GA1含量的顯著增加(圖1,右),其中,XeB1的GA1含量為3792.7pmol/g(FW),XeB2的GA1含量為3174.7pmol/g(FW),分別是對照的3.4倍和2.8倍.長穗頸水稻穗子和葉子里GA1含量的急劇增加,恰好與其最上節(jié)間的劇烈伸長相一致(表1),而GA1是促進水稻節(jié)間伸長的至關(guān)重要的內(nèi)源激素[6～8],因此,幼穗、劍葉內(nèi)GA1水平的劇烈增加很可能為eui水稻的最上節(jié)間提供了大量的激素儲備,從而誘導(dǎo)了長穗頸水稻最上節(jié)間異乎尋常的伸長.比較eui1和eui2水稻的激素含量,在抽穗始期,XeB1穗子里的GA1含量顯著高于對照和XeB2,分別為5957.3、370.3和1001.2pmol/g(FW),這種GA1水平的顯著差異可能是導(dǎo)致eui1水稻的最上節(jié)間也顯著長于eui2水稻(表1)的主要原因.在最上節(jié)間伸長期,XeB1、XeB2和XB最上節(jié)間的GA1含量分別為258.6、408.6和146.4pmol/g(FW),三者間有一定差異,但未達顯著水平.比較不同取樣部位的GA1水平,3個等基因系節(jié)間的GA1含量均顯著低于幼穗和劍葉(數(shù)據(jù)未列出),由此看來,幼穗和劍葉可能是更重要的GA1儲備部位.2.1.2eoi1水稻有機溶劑最佳來源eui2水稻ABA含量的動態(tài)變化基本與對照Eui水稻相同,而eui1水稻的表現(xiàn)較為獨特.在劍葉內(nèi)的表現(xiàn)為:幼穗分化第4期(第3節(jié)間伸長期),eui1水稻劍葉內(nèi)的ABA含量顯著高于eui2水稻和Eui水稻,高達20.05nmol/g(FW);而在幼穗分化第7期(第2節(jié)間伸長期),eui1水稻劍葉內(nèi)的ABA含量急劇降至0.58nmol/g(FW),保持與eui2和Eui水稻相近的水平;在抽穗始期,eui1水稻的ABA含量有所回升(圖2).eui1水稻幼穗內(nèi)的ABA含量表現(xiàn)了某種相反的趨勢:在幼穗分化第4期,eui1水稻幼穗內(nèi)的ABA含量與eui2和Eui水稻差異不顯著;在抽穗始期,XeB1幼穗內(nèi)的ABA水平顯著高于eui2水稻和對照,分別為13.67、7.62和9.39nmol/g(FW).根據(jù)上述結(jié)果,較難明確eui1和eui2水稻的ABA含量對水稻節(jié)間伸長的影響,據(jù)Hoffmann觀察,GA1和ABA間的比值才是最終決定水稻節(jié)間伸長的重要因素,本文因此研究了長穗頸水稻GA1/ABA比值的動態(tài)變化.2.1.3水稻的ga1/aba配比GA1/ABA比值的動態(tài)變化與GA1水平的動態(tài)變化較一致(圖3):在最上節(jié)間伸長期,eui水稻無論在穗子還是在劍葉里均表現(xiàn)出比對照明顯高的GA1/ABA比值;eui2水稻主要在在劍葉里表現(xiàn)出比對照明顯高的GA/ABA比值,這從激素的交互作用方面解釋了eui1、eui2水稻最上節(jié)間顯著伸長、eui1水稻其最上節(jié)間顯著長于eui2的原因.2.2關(guān)于eue1、eua2對水稻株高的影響烯效唑S3307為GA生物合成抑制劑.關(guān)于烯效唑作用機理,普遍認為其作用途徑是阻礙貝殼杉烯C19甲基的氧化,從3個作用點上抑制或阻斷赤霉素的生物合成.本研究試圖通過對長穗頸水稻噴施烯效唑,來考察是否長穗頸水稻的節(jié)間伸長主要涉及到GA1含量的變化.在水稻上部節(jié)間即將伸長的幼穗分化8期,對協(xié)青早的3個保持系品系噴施了不同濃度的S3307,結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn):(1)在接受濃度為32mg/kg和64mg/kg的GA抑制劑S3307的處理時,XB、XeB1、XeB2的最大株高受抑值依次為20.33cm、25.6cm和23.14cm.這表明,S3307處理能夠顯著地降低eui1、eui2的株高,可以認為,eui1、eui2的上部節(jié)間伸長在很大程度上受體內(nèi)GA含量的影響.(2)未能通過S3307的處理使eui1水稻的株高受抑達到野生型的高度,但可以使eui2水稻株高受抑達到野生型的高度.這進一步表明,eui2促進的節(jié)間伸長主要與GA含量有關(guān)系.而eui1植株未降低到和野生型相同的水平,可能有兩個原因:第一,與GA含量有關(guān)系,但由于劍葉鞘的保護,在eui1水稻穗子里GA1的合成未受到抑制,抽穗期穗子里的GA1仍能促進節(jié)間的伸長;第二,eui1基因所促進的節(jié)間伸長尚有GA含量以外的因素起作用,如莖節(jié)間組織對GA1的敏感性.2.3伸長的影響2000年9月在幼穗分化8期,對XeB1、XeB2和XB這3個品系的植株施加了刪除某一器官的處理,于成熟期考察穗部和葉部器官對節(jié)間伸長的影響.試驗結(jié)果表明,與對照F相比:(1)刪除劍葉(A)、刪除第2葉(C)對第1節(jié)間的伸長幾乎無影響;刪除第2葉+第2葉葉鞘(D)只輕微地降低了最上節(jié)間的長度.(2)刪除劍葉+劍葉鞘(B)能顯著地降低節(jié)間長度,但3個品系的受抑程度相近.(3)刪除幼穗嚴重抑制了3個品系的第一節(jié)間伸長,其中以eui1水稻受抑程度最顯著.同樣是刪除幼穗,XB、XeB1、XeB2的最上節(jié)間長分別由原來的26.8cm、56.7cm、39.5cm降低到19.6cm、32.0cm和31.2cm,受抑率分別為26.9%、43.5%和21%,只有含eui1的水稻對刪除幼穗最敏感,最上節(jié)間伸長受抑率最高.結(jié)合內(nèi)源激素的測試結(jié)果,可以推斷,eui1所誘導(dǎo)的最上節(jié)間的伸長主要源于幼穗中GA1含量的劇烈增加,穗子里高含量的GA1為最上節(jié)間的劇烈伸長提供了充足的激素儲備.3結(jié)論和討論3.1eoi1和sd1在全生育期上的調(diào)高表現(xiàn)為于幼穗分化7期至抽穗始期,攜eui1的水稻XeB1能自身產(chǎn)生大量的GA1,所產(chǎn)生的部位尤以穗顯著.其穗子里的GA1水平比野生型高約16倍,其GA/ABA比例明顯增加.eui1水稻高含量的GA1水平恰好與XeB1極長的最上節(jié)間長度相對應(yīng).當(dāng)XeB1幼穗分化8期接受GA合成抑制劑處理時,其株高能降低25cm,說明eui1促進節(jié)間伸長在很大程度上是因為調(diào)高了GA1含量.在幼穗分化8期去除XeB1的幼穗(留基部5個枝梗),其抑制XeB1最上節(jié)間長度的效應(yīng)大于GA合成抑制劑處理,節(jié)間長度降低到與對照XB相近的水平(圖5),這充分說明,eui1顯著促進最上節(jié)間、第2節(jié)間的伸長主要來源于其在穗子里的強烈表達.在抽穗始期,eui1水稻劍葉內(nèi)的GA1含量顯著高于Eui水稻,說明eui1也促進GA1水平在劍葉內(nèi)的顯著增加.eui1基因促使節(jié)間劇烈伸長的原因可能還包括莖節(jié)間組織對GA1的敏感性.據(jù)何祖華等觀察,與其他株高基因相比,eui1和sd1基因在全生育期均表現(xiàn)了對外源GA3更高的敏感性.eui1基因?qū)ν庠碐A3敏感,說明對體內(nèi)的GA1也敏感.eui1基因這種敏感性可能與受體的多少、受體與激素的親和性等有關(guān)系.eui1基因還有可能通過調(diào)高赤霉素受體水平來控制最上節(jié)間的長度.3.2eoi2基因缺失在抽穗始期,eui2基因表達的最明顯的特征是促進了劍葉內(nèi)GA1含量的顯著提高及GA/ABA比例的明顯增加.在幼穗分化8期對XeB2作去除幼穗處理時,XeB2的最上節(jié)間伸長雖然顯著受抑,但受抑程度遠低于XeB1的受抑程度,這意味著eui2基因在穗子里未有特異表達.但XeB2接受S3307處理時,株高生長顯著受抑,可以降到與對照XB相同的水平,說明eui2水稻的節(jié)間伸長也是因為調(diào)高了GA1含量.其表達時期可能在抽穗期,表達部位可能在劍葉里.eui2基因的作用機理有待于進一步搜集數(shù)據(jù),獲得較確切的結(jié)論.3.3ga基因關(guān)于秸稈伸長的基因Choi等比較水稻正常和矮稈品種的GA1水平時,以葉片為取樣部位;Hoffiman等探索深水稻上部節(jié)間伸長機制時,以伸長節(jié)間基部為取樣部位.為探索eui的作用機理,本研究選擇了穗、劍葉、節(jié)間基部3個取樣部位.劍葉和幼穗是否具有代表性?Silverstone等的研究結(jié)果提供了較有說服力的證據(jù).試驗結(jié)果表明,與GA合成有關(guān)的基因GA1的啟動子主要表達部位為莖尖、根尖、發(fā)育著的花、種子及充分伸展的