電鏡觀察樣品時應注意的幾個問題

一、對觀察內(nèi)容的初步鑒定

低放大倍數(shù)下（3000倍），根據(jù)細胞的形態(tài)和輪廓、細胞內(nèi)和細胞間物質(zhì)的伸延情況基本上可對組織類型做出初步判斷。

二、正確使用放大倍數(shù)一般對組織的觀察，從低倍開始；觀察病毒在2-3萬倍以上，觀察大分子結(jié)構(gòu)要10萬倍以上。

三、局部與整體

通觀全局，避免片面性。一個細胞的超薄切片只是一個細胞的1/100-1/500。觀察時現(xiàn)場記錄；典型的代表性結(jié)構(gòu)需攝片；經(jīng)常需設對照組；觀察時2-3人為宜，對重要發(fā)現(xiàn)要相互核實。

四、形態(tài)與功能

例如，腎衰時，尿中鈉離子增高，近曲小管上皮細胞變性。

五、動與靜的對立統(tǒng)一

肝細胞壽命----18個月

紅細胞壽命----120天，每人每天平均死亡一千幾百億紅細胞

消化管內(nèi)壁細胞壽命----幾十小時

細胞發(fā)育早、中、晚期，機體發(fā)育幼年、青年、壯年、老年六、人工損傷及其識別

1、標本制作中人工損傷＊固定損傷:延誤固定時間，固定液滲透壓＊包埋損傷＊超薄切片損傷:刀痕，顫痕＊玷污:鉛污染

2、電子束轟擊七、電鏡技術(shù)及其它先進技術(shù)結(jié)合

1、與中醫(yī)相結(jié)合

2、與免疫電鏡、細胞化學、能譜相結(jié)合掃描探針顯微鏡及其在

生物醫(yī)學中的作用掃描探針顯微鏡及其在

生物醫(yī)學中的應用

醫(yī)學的每一步前進必然建立在科技發(fā)展的基礎(chǔ)上，如1858年開始的光學顯微鏡觀察使對疾病的認識到達了細胞水平，1950年出現(xiàn)的電子顯微鏡把對疾病的認識提高到了亞細胞水平。當代醫(yī)學的發(fā)展已經(jīng)到達了分子生物學廣泛應用的時代，人們迫切需要對分子水平的結(jié)構(gòu)、形態(tài)進行直接的觀察，掃描探針顯微鏡（SPM）的問世正是滿足了這一要求。

雖然電子顯微鏡的發(fā)明大大提高了成像分辨率，但苛刻的樣品制備條件容易改變生物分子的天然結(jié)構(gòu)；另外，高真空狀態(tài)的成像偏離生物分子生理環(huán)境太遠，使我們很難獲得生物分子的真實結(jié)構(gòu)信息和反應過程。應用SPM觀察物體可達到10－8m，并可直接對標本進行觀察，應用范圍之廣出乎人們的意料，其潛在的巨大作用正在被開發(fā)。

SPM主要類型有：掃描隧道顯微鏡（STM）、原子力顯微鏡（AFM）、掃描力顯微鏡（SFM）、掃描磁顯微鏡（SMM）等，隨著SPM領(lǐng)域的新技術(shù)的高速發(fā)展，還會有新的型號出現(xiàn)，但其基本原理是建立在量子力學和壓電材料技術(shù)上的。掃描隧道顯微鏡

掃描隧道顯微鏡（STM）是根據(jù)量子力學的電子隧道效應設計的。當針尖（探針）與樣品表面距離小于1nm以下時，針尖電子云與樣品表面電子云重疊----加上微小電壓（2mV-2V）---針尖和樣品間產(chǎn)生隧道電流樣品++++++++++++++++++V(2mV-2V)++++++L＜1nm

針尖到樣品表面原子的距離與隧道電流成指數(shù)關(guān)系，所以間距的變化對隧道電流的反應是十分敏感的。當針尖在樣品表面掃描時，間距則隨樣品表面起伏不平的形貌而變化著，因而隧道電流也隨之變化著。記錄變化的隧道電流，則可獲得樣品表面的形貌特征，達到觀察樣品表面原子結(jié)構(gòu)圖像的目的。但是它要求被觀察的樣品必須具有導電性，因此對生物樣品的觀察就受到限制。原子力顯微鏡

原子力顯微鏡（AFM）的發(fā)明是建立在掃描隧道顯微鏡的基礎(chǔ)上的，利用對微弱力極其敏感、頂端帶針尖的微懸臂對樣品表面進行逐行掃描，針尖最外層原子與樣品表面原子之間的相互作用力使微懸臂發(fā)生形變或者改變運動狀態(tài)，通過檢測微懸臂的偏轉(zhuǎn)獲得樣品形貌和作用力等相關(guān)信息供計算機成像。因此，AFM不要求樣品具有導電性，待測樣品不需要特殊處理就可以直接進行納米尺度的觀測。AFM在液態(tài)環(huán)境中也可成像，而且針尖對樣品表面的接觸作用力較小，能避免對樣品造成大的損傷，所以AFM成為對自然狀態(tài)下的細胞、生物大分子等進行納米尺度實時觀測的有效工具。生物樣品標本制備

一般生物標本在常壓、液態(tài)環(huán)境中可直接觀察。培養(yǎng)細胞：取培養(yǎng)在玻片上的細胞，用PH7.4的PBS緩沖液洗，1.5%戊二醛固定5分鐘，蒸餾水沖洗3次，干燥，AFM觀察。生物樣品超薄切片法：標本在冰凍的2%戊二醛固定后，經(jīng)過0.1mol/lPBS緩沖液沖洗，乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷中過夜，環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片定位，超薄切片撈在新解離的云母上，干燥后用AFM在空氣中進行觀察。應用

AFM對細胞膜表面研究分為：第一階段是對大量的細胞膜表面（包括細胞內(nèi)、外表面）外貌、粘度、硬度、彈性、力學等信息的觀測。第二階段是對膜表面的標記物（如抗體）和作用物（如藥物和甾體物質(zhì)）的觀察。第三階段對信息傳導、細胞連接、細胞膜表面生化反應等的研究。目前研究主要處于前兩個階段。

AFM在核酸及其蛋白質(zhì)復合物結(jié)構(gòu)研究中的應用已日趨廣泛。為了提高AFM成像分辨率、保證所獲得結(jié)果的可靠性和再現(xiàn)性，必須重視DNA樣品的制備過程。成像DNA分子時，選擇合適的針尖、合適的成像方式、合適的成像環(huán)境，減小針尖和DNA分子間的力作用，都有利于提高成像質(zhì)量。評價AFM的被測樣品無需進行復雜的處理，對成像環(huán)境也沒有什么特別要求，保證了所觀察的樣品表面結(jié)構(gòu)的真實性。由于AFM針尖采集的表面結(jié)構(gòu)圖可在掃描過程中以三維形式直接顯示到計算機屏幕上，因此可以定量分析被檢測樣品