現代儀器分析技術在中藥炮制機理研究中的應用

1中藥制劑學發展概況中醫藥的制備是根據中醫藥理論和辨證論治的需要、藥物本身的性質以及藥物適應和制劑的不同要求而進行的一種制藥技術。這一傳統的制藥技術是根據人體的臨床經驗積累的，是中華民族歷代醫家智慧的結晶。經過加工和加工后，中藥被稱為中藥飲片。中藥飲片是中醫臨床處方的一種處方，也是中藥生產的一種西藥。因此，中藥飲片的規范化和規范化是中醫學現代化的重要因素之一。國家將中藥飲片的生產技術和中藥飲片的質量標準產業納入我國最重要的高新技術產業化領域之一。中藥經過加工炮制以后,藥性和臨床功效都發生了明顯變化,這說明中藥在炮制過程中發生了變化,如何表征中藥在炮制過程中發生的變化及其規律是中藥炮制機理研究的一個重要課題.在傳統的中藥炮制理論中,我們已經有了一套簡單而生動的理論來解釋這種變化,如“鹽制入腎,醋制入肝,酒制升提…”.在缺乏現代分析技術與方法的時代,人們無法在微觀領域看到中藥在炮制前后發生的變化然而祖先在中醫理論的指導下,發展了中藥炮制理論,這是一個創新,它極大地推動了中藥炮制學的發展.隨著現代實驗科學的引入,我們在進行中藥炮制原理研究中開始探索使用藥理學方法,通過動物實驗比較炮制前后的藥效學差異.但由于中醫病癥模型難以復制等原因,很難得到可靠的結果.而今天當現代儀器分析技術發展到可以在微觀層面上分析這種變化時,我們就有必要全方位地探索中藥炮制的機理,這樣才能把中藥炮制學向更高層次推進.20世紀80年代以來,分析化學發展迅速,各種新的分析技術、分析方法和分析儀器不斷涌現,為復雜體系的分析提供了有力的手段,在中藥現代研究中已經得到了推廣和應用,也大大推動了中藥炮制學的發展.在中藥炮制機理研究領域,各種最新的現代儀器分析技術都已經有應用,取得了較多成果可以說,中藥炮制機理的現代研究是伴隨著現代儀器分析技術的發展而發展的.本文結合本實驗室的研究工作,對近年來各種現代儀器分析技術在中藥炮制機理研究中的應用進行了綜述.2光譜技術2.1利用紫外光譜法研究.主要問紫外光譜主要用于化合物的結構鑒定和含量測定,根據中藥所含組分的不飽和程度,可以利用紫外光譜進行鑒別.UV具有儀器普及、操作簡單、樣品用量少等特點,可以在宏觀上研究中藥炮制前后組分的變化,為進一步的炮制機理研究提供依據.但此方法提供的信息量少,且易受溶劑和雜質的影響,準確度和重現性不高.如徐自升等利用紫外光譜法研究了懷山藥炮制前后的變化,發現生山藥在269nm和220nm處有吸收,而山藥與麥麩加熱炮制后在258nm和222nm處有吸收,表明懷山藥炮制前后成分發生了變化.烏莉婭·沙依提等研究了維吾爾藥孜然炮制前后紫外光譜的變化,結果表明孜然醋制前后的紫外吸收光譜圖發生明顯變化,生藥孜然中224nm、260~360nm的紫外吸收峰明顯減弱,這可能是醋制過程中某些蒽醌類及含苯類成分得以減少或清除引起的.紫外光譜的變化必然伴隨著成分的改變,以上研究也說明紫外光譜可以用于在整體上研究中藥炮制前后的變化.2.2紅外光譜分析技術在中藥中的應用拓展紅外光譜是利用化合物在低能量照射下分子發生振動的原理來提供結構信息,可提供分子中有關官能團的內在信息,可以進行定量及無損分析.IR能夠提供樣品的綜合信息,靈敏度高、操作簡便、譜帶專屬性強,借助IR可對中藥炮制前后的成分變化進行分析和預測,從而為闡明中藥炮制機理奠定基礎.近年來,二維紅外相關光譜技術(2D-FTIR)得到較快發展,提高了紅外光譜圖的分辨率,可以在揭示分子內/分子間的相互作用及判斷分子各官能團反應的先后順序研究中發揮作用,也可以有效地揭示中藥炮制前后的變化規律.如XuCH等利用傅立葉變換紅外光譜法結合二維紅外光譜技術研究中藥蔓荊子炮制前后的變化,結果顯示二階導數紅外光譜信息有一定的指紋性,而二維紅外光譜有更強的特征性,能夠有效地區分蔓荊子生品和炮制品.其炮制機理是炮制后脂類成分大量減少,而黃酮類成分減少不多,從而造成黃酮類成分的相對含量先升高,后降低的趨勢.中藥地黃經黃酒加熱蒸制后稱為熟地黃,其功效發生了很大的變化,其所含成分也必然發生了轉變.利用二維紅外光譜技術對地黃蒸制過程進行動態連續跟蹤分析,發現地黃蒸制過程中二維紅外光譜發生了顯著的變化(圖1).由于地黃中含有大量的水蘇糖,根據炮制過程中二維紅外光譜變化規律,且地黃炮制后變甜,說明炮制過程中可能有果糖生成,由此推測地黃炮制的機理包含水蘇糖水解的過程(圖2),從而引起藥效的變化.這也提示我們,中藥炮制機理十分復雜,采用傳統的分析方法可能無法得出可靠的結果,有必要采用更有針對性的分析技術進行全面的研究,可能得出正確的結論.2.3熒光光譜定量分析常用的原子光譜分析法包括原子吸收光譜(AAS)、原子發射光譜(AES)和原子熒光光譜(AFS).原子吸收光譜是指由待測元素燈發出的特征譜線通過供試品蒸氣時,被蒸氣中待測元素的基態原子所吸收,吸收遵循一般分光光度法的吸收定律,通過測定輻射光強度減弱的程度可求出待測元素的含量,是中藥中微量元素定量分析的常用方法.原子發射光譜法是利用物質在熱激發或電激發下,每種元素的原子或離子發射特征光譜來判斷物質的組成,而進行元素的定性與定量分析的方法,其中最為常用的是電感耦合等離子體原子發射光譜法(ICP-AES).原子熒光光譜是介于原子發射光譜和原子吸收光譜之間的光譜分析技術.它的基本原理是基態原子吸收合適的特定頻率的輻射而被激發至高能態,而后激發過程中以光輻射的形式發射出特征波長的熒光.這三種方法的原理不同,但都具有較高的靈敏度和較寬的線性范圍,非常適合微量元素的定量分析.由于微量元素與中藥藥效有一定的相關性,因此,探索炮制前后微量元素的含量成為研究中藥炮制機理的重要方向之一.如李軍等采用AAS法測定柴胡不同炮制品中5種微量元素的含量,結果在3種炮制品中,柴胡醋炙品中5種微量元素的含量最低,酒炙品中Fe、Mg、Zn含量最高.可見炮制對柴胡中微量元素的含量有一定的影響.宋秀環等采用AFS法對不同粒度雄黃及其炮制品中可溶、毒性砷含量進行檢測,實驗發現,礦物藥雄黃粒度以100~200目為宜,酸水淬飛炮制最佳,在還原性氫氣和惰性氬氣氛圍中保存,時間短、溫度低、濕度小,產生的易溶劇毒物三氧化二砷(As2O3)較少,通過炮制處理降低毒性成分的含量是礦物藥雄黃中炮制的主要目的.我們實驗室也在從事中藥炮制前后微量元素含量變化研究.我們采用ICP-AES法對山茱萸生品和山茱萸炮制品中的微量元素進行分析,結果在山茱萸生品溶出液中檢出十八種無機元素.溶出液富含K、Ca、Mg等元素,炮制后除Cu明顯下降,Ba、Ni基本不變外,其他各種元素均有不同程度的增加,稀土元素La、Ce等元素含量增大明顯,這些變化可能是山茱萸用黃酒蒸制后補肝腎作用增強的物質基礎.礦物藥如自然銅,雄黃等是中藥的重要組成部分,它們基本上由無機物組成,因此針對微量元素開展礦物藥炮制機理的研究就顯得更為重要.我們也曾采用ICP-AES法對自然銅,赭石高溫煅制前后的微量元素進行研究,發現高溫煅制后微量元素的煎出量變化很大(表1),這些變化是礦物藥煅制后藥效變化的主要機理.3色度法3.1馬錢子的制劑機理研究薄層色譜是將適宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或鋁基片上,形成一均勻薄層,待點樣、展開后,與適宜的對照物按同法在同板上所得的色譜圖作對比,并可用薄層掃描儀進行掃描.TLC操作簡單,色譜結果直觀,具有分離、鑒定雙重功能,是中藥分析的常用手段,在中藥炮制機理研究中也得到了廣泛的應用.我們實驗室在國內較早采用此方法進行中藥馬錢子的炮制機理的研究.研究發現,馬錢子經過砂燙炮制后,士的寧和馬錢子堿在水煎液中含量均有不同程度的下降,而士的寧氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物在水煎液中含量均有所增加,可能是部分士的寧和馬錢子堿在高溫條件下轉化為士的寧氮氧化物和馬錢子堿氮氧化物(圖3).進一步研究發現士的寧單體在加熱過程中的確會發生一系列的轉化,生成士的寧氮氧化物等成分,通過對這些成分的藥效進行進一步的相關性研究,解釋了馬錢子炮制減毒的機理.此外,我們還采用TLC法研究了馬錢子炮制前后其他成分的含量,如馬錢子苷等,從而基本闡明了馬錢子的炮制機理.但TLC也有局限性,如靈敏度低、準確度不高、影響因素較多,對含量很低的成分不易觀察到,嚴重制約了它的應用.近年來,薄層色譜技術有了新的發展,出現了高效薄層色譜、微乳薄層色譜等,TLC正朝著測定過程標準化、自動化的方向發展,這些進步將使TLC在中藥炮制機理研究中的應用更加廣泛.3.2化學成分分析高效液相色譜是以液體溶劑作為流動相的色譜技術,有分離效能高、選擇性高、檢測靈敏度高和分析速度快的特點.HPLC是目前中藥成分分析中極有應用價值的技術,隨著樣品純化技術的提高,HPLC能夠更準確地定量分析中藥成分,是中藥炮制機理研究的重要手段之一.我們利用HPLC技術對山茱萸炮制前后的指紋圖譜進行了定性定量分析,結果顯示山茱萸經黃酒加熱蒸制后各主要成分都發生了比較明顯的變化,其中5羥甲基糠醛(5-HMF)的含量明顯增加(見圖4),這些成分含量的變化與其藥效密切相關,也是山茱萸的炮制機理的一部分.王維皓等利用HPLC方法對生姜、干姜、炮姜、姜炭進行了化學成分的分析比較,結果從中指認出6-姜辣素、6-姜酚和姜酮3個色譜峰.從生姜到干姜、炮姜、姜炭的炮制過程中,6-姜辣素逐漸降低,6-姜酚逐漸增高,姜酮在加工至炮姜時出現,且含量最高,而干姜和生姜中沒有.可見生姜隨著加工炮制火候和條件的逐步劇烈,所制成的干姜、炮姜、姜炭制品中的酚類成分在含量和成分間的比例上發生了變化,這些變化與其功效的改變息息相關.LiuZ等利用HPLC法分析何首烏加熱蒸制后新產生成分2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4氫-吡喃-4-酮(DDMP)和5-HMF的含量隨炮制時間的變化,結果發現在高溫蒸制的60h時間內,隨蒸制時間的延長DDMP的含量逐漸升高,至蒸制24h達到最高,隨后開始逐漸降低;5-HMF的含量隨炮制時間的延長逐漸升高,這些結果表明何首烏在蒸制過程中發生了美拉德反應,這是何首烏炮制前后藥效變化的主要機理.由此可見,中藥炮制后功效變化的基礎是成分的變化,這種變化既可以是質變,也可能是成分的含量和比例的變化,其中的過程十分復雜,需要進行全面的分析和比較.3.3在制劑分析中的應用高效毛細管電泳是以高壓電場為驅動力,毛細管為分離通道,依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的一類液相分離技術,具有分離效率高、所需樣品少、溶劑消耗少等特點.HPCE已經日益廣泛的應用于生物堿、黃酮、酚類、有機酸、香豆素及其他成分的分離、鑒別和含量測定,在炮制前后中藥成分分析中也已有應用研究.如高言明等建立了毛細管區帶電泳法研究黃連、黃柏炮制前后小檗堿的含量變化,發現黃連和黃柏藥材經炮制后,其中鹽酸小檗堿的含量都有一定程度下降,原因可能是在炮制過程中小檗堿因溫度增加而被分解.4波譜法4.1種特殊的毒性成分質譜分析是通過對樣品離子的質量和強度的測定,來進行化學成分和結構分析的一種方法.質譜能夠給出有機化合物的分子量、分子式、分子離子和碎片離子,以及揭示生成碎片離子的裂解方式和有機分子結構類型關系的規律性.目前,還出現了串聯質譜,最常見的是三級四極桿串聯質譜,此技術大大擴展了質譜的應用范圍,在分析組成復雜的中藥成分中尤有優勢,在中藥炮制機理研究中也有著廣闊的應用空間.烏頭是一味有毒中藥,其主要毒性成分為雙酯型生物堿,如烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿,但經過炮制后毒性降低.烏頭的炮制要經過長時間的水加熱處理,將炮制前后的烏頭樣品分別直接進樣,進行質譜分析.結果發現在烏頭的乙醇提取液中,烏頭堿(AC,m/z646)、中烏頭堿(MA,m/z632)和次烏頭堿(HA,m/z616)三種主要毒性成分含量很高;而在水加熱處理后得到的水煎液中,三種毒性成分含量明顯降低,而苯甲酰烏頭原堿(BA,m/z604)、苯甲酰中烏頭原堿(BM,m/z590)和苯甲酰次烏頭原堿(BH,m/z574)的含量明顯升高(見圖5),炮制過程中發生的脂交換反應是烏頭炮制的機理.在此基礎上,越皓等利用電噴霧質譜方法(ESI-MS)分析了附子加輔料(甘草)炮制前后水煎液中二萜類生物堿在種類和含量方面的變化,發現附子與甘草共煎液中的次烏頭堿、中烏頭堿和烏頭堿的相對含量分別是單煎液中的5.67%、4.05%和4.88%因為在炮制過程中甘草中的成分容易與附子中雙酯型生物堿及其熱解產物發生脂交換反應,生成毒性更小的脂類生物堿,同時有少量的雙酯型生物堿與甘草中的甘草酸等成分形成了難溶性的沉淀,上述反應的結果是降低了附子中雙酯型生物堿的含量,從而達到炮制減毒的目的.這些研究表明,質譜技術可以用于中藥成分的快速定性分析,在中藥炮制機理研究特別是炮制前后成分變化的快速鑒定方面有著廣闊的應用前景.4.2在中藥分析過程中,對化學成分進行了更多的分NMR技術是利用具有自旋性質的原子核在外磁場作用下,吸收射頻輻射而產生能級躍遷的一門波譜學技術,是鑒定化合物結構的最重要方法之一.近年來,NMR已經被探索應用于中藥的鑒別,也有研究用NMR進行中藥成分的定量分析,但是由于儀器昂貴,這些方法的普及還比較困難.目前,在中藥炮制機理研究中,NMR的應用仍局限于對炮制前后成分的結構鑒定方面.如LiaoPY等采用化學分離法研究了人參加熱蒸制后的化學成分,采用1D-NMR和2D-NMR對這些化學成分進行結構鑒定發現分離得到的27個達瑪烷型三萜類化合物中,包括4個新的糖苷類成分,是蒸制過程中產生的,說明人參蒸制過程中會產生新成分,這些成分與藥效的相關性研究對闡明人參的炮制機理有重要意義.隨著NMR技術的發展與進步,可以大大加快化合物結構鑒定的速度和準確度,同時NMR技術也在不斷拓展在中藥研究中的應用范圍,在中藥炮制機理研究中也將發揮更大的作用.5生物分析技術5.1凝膠電泳技術電泳技術在中藥領域的應用主要是蛋白質凝膠電泳,蛋白質凝膠電泳技術經過迅猛發展,已成為高分辨率和高靈敏度的現代分析技術,廣泛用于中藥鑒別和質量控制.凝膠電泳根據脂蛋白顆粒大小將其分離,脂蛋白通過濃度呈梯度增高的聚丙烯酰胺在電場中移動,當達到分離極限時,顆粒的移動停止,此時的脂蛋白分布圖即凝膠電泳圖譜具有特異性,從而達到鑒別藥材的目的.中藥炮制前后發生變化的物質多種多樣,大分子蛋白質等物質也可能會有變化,這就有必要采用電泳技術等新的分析手段,全面挖掘中藥炮制前后的變化.如張林碧等用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術測定以不同的炮制方法制得的人參、僵蠶、雞內金和虻蟲的炮制品與原藥材的蛋白質區帶圖譜,結果發現4種樣品炮制前后均有明顯的變化,其中蒸煮法和砂炒法對藥材蛋白質的影響較烘焙法和麩炒法大,損失多,原因可能是溫度高、時間長的炮制方法使蛋白質損失得更多.5.2中藥制劑研究DNA分子標記技術是在分子水平上通過檢測遺傳物質的多態性來鑒定中藥,DNA分子標記技術以特異性強、可靠性好、靈敏度高等特點,在中藥材質量評價中的應用逐步擴大,方法也日趨完善,在中藥炮制機理研究方面也已有了一些應用.如許臘英等探討了蒼術炮制前后DNA指紋圖譜研究方法,采用隨機擴增多態性(RAPD)技術對不同產地的茅蒼術炮制前后進行DNA指紋圖譜研究.結果發現,不同產地的茅蒼術生品DNA指紋圖譜一致,幾種麥麩炒蒼術的DNA指紋圖譜與生品有較大差異,主要包括條帶較少、缺乏較長堿基對的擴增條帶,說明蒼術與麥麩加熱炮制后造成DNA不同程度降解,另外幾種炮制品之間也存在不同程度差異,說明炮制對藥材DNA分子有較大影響.6色譜聯用技術色譜技術分離能力強、檢測靈敏度高,是中藥分析的首選技術,但是,對于未知化合物定性方面難以給出可靠信息,而光譜和波譜技術具有很強的鑒定未知化合物結構的能力,因此,將色譜與光譜或波譜聯合應用,已逐漸成為中藥現代研究的強有力手段.近年來,色譜聯用技術在中藥炮制研究中的應用不斷發展和普及,目前應用最廣泛的有GC-MS聯用、LC-MS聯用.一些更先進的聯用技術,如HPCE-MS聯用、LC-MS/MS聯用、HPLC-NMR-MS聯用等也應探索應用于中藥炮制機理研究中.6.1gc-ms分析及其應用氣質聯用技術是將氣相色譜與質譜聯用,從而實現復雜成分的在線分離和鑒定,使快速鑒定中藥中的成分成為可能,主要用于分析中藥中的揮發性成分.中藥經過炮制以后,其中的揮發性成分會有較大變化,有含量的變化,也有結構的變化,這些變化可能與中藥炮制機理密切相關,GC-MS的應用為闡明這些變化提供了有力手段.如張帆等利用GC-MS研究了小茴香不同炮制品中的揮發性成分,結果表明小茴香經不同輔料炮制后揮發油含量顯著降低.炮制前后反式-茴香腦含量均最高,生品中24種化合物經不同方法炮制后含量均發生了變化.炮制過程中還發生了成分轉化,共新產生了18種化合物,這些變化是小茴香炮制后功效改變的基礎,也是小茴香炮制機理之一.袁子民等對肉豆蔻煨制前后的揮發油進行GC-MS分析,發現肉豆蔻與麥麩加熱煨制后揮發油成分發生了質和量的變化,新產生了13個成分(見表2),4個成分消失,止瀉成分甲基丁香酚、甲基異丁香酚含量增加,毒性成分肉豆蔻醚、黃樟醚含量降低,說明肉豆蔻采用水浸泡麩煨進行炮制具有科學意義.6.2不同方法對中藥山基層黨組織的質譜監督液質聯用技術是將液相色譜與質譜聯用,液相色譜具有高效分離能力,而質譜具有高效鑒定能力,二者聯用可以實現中藥復雜成分的在線分離和鑒定.由于中藥中大量成分都適用于液相分析,因此液質聯用的產生對中藥復雜成分的定性定量分析起巨大的推動作用,在中藥炮制研究中,LC-MS技術也將成為闡明炮制前后的成分變化,進而闡明中藥炮制機理的重要方法.如周莉莉等利用高效液相色譜-電噴霧多級串聯質譜(HPLC-ESI-MSn)聯用技術,對中藥山茱萸的炮制機理進行了研究,通過電噴霧一級質譜獲得了7個環烯醚萜苷類化合物的分子量信息利用質譜的源內碰撞誘導解離技術,獲得了該類化合物在負離子模式下的碎裂特征,在此基礎上,對其進行了結構鑒定和含量分析,發現山茱萸炮制后,7種環烯醚萜苷類化合物的含量都有所增加.此外,何忠梅等利用LC-MS技術研究了芍藥炮制前后的變化研究發現芍藥經黃酒加熱炮制以后酚酸類成分含量明顯下降,這些變化是芍藥炮制后功效改變的基礎.7當前問題和對策7.1現代儀器分析技術的應用光譜技術、色譜技術及多種波譜技術在中藥炮制機理研究中已經有了較為廣泛的應用,特別是HPLC和GC-MS在中藥炮制前后的成分分析方面.但是中藥炮制前后的成分變化是極其復雜的,炮制過程中發生的很多變化,采用現有的分析手段可能仍然無法全面解釋清楚.因此,不能一味套用前人的研究思路與方法手段,有必要應用最新的儀器分析方法,有針對性地探索中藥炮制的機理.目前,我們在新的儀器分析技術的引入和應用方面仍顯不足,比如凝膠電泳技術和質譜技術能夠有針對性地分析炮制前后的一些變化,但在實際研究中仍然應用較少.很多新近產生的現代儀器分析技術如高效液相色譜-核磁共振(HPLC-NMR)聯用技術、毛細管電泳-電噴霧-飛行時間質譜(CE-ESI-TOF-MS)聯用技術、高效液相色譜-電噴霧-離子阱飛行時間質譜(LC-ESI-IT-TOFMS)、全二維液相色譜技術(LC×LC)等在中藥炮制原理研究中尚無應用,需要進一步嘗試應用.7.2中藥的結構變化需要現代儀器分析技術的應用.對于中藥中藥炮制過程中可能發生了復雜的變化,而闡明這種變化需要依靠多種現代儀器分析技術.因此在中藥炮制機理研究中,以一種分析手段得到的結果作出結論不夠可靠,也是不夠科