植物dna去甲基化酶基因的克隆與功能分析

二甲基硝基化是一種重要的表觀遺傳特征，包括組織機(jī)械的壓碎、重組印花、x染色體的失去等生物學(xué)過(guò)程。DNA甲基化能夠調(diào)節(jié)植物的早期發(fā)育、基因座專一性基因表達(dá)。在高等植物中,有CG、CHG和CHH(H代表A、C或T)3種甲基化位點(diǎn),其中CG和CHG位點(diǎn)的甲基化是直接調(diào)節(jié)基因表達(dá)最主要的甲基化形式。DNA的甲基化水平和模式取決于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶。植物中的甲基轉(zhuǎn)移酶主要有甲基轉(zhuǎn)移酶1(MET1)、結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶(DRM)和染色質(zhì)甲基化酶(CMT)3類,對(duì)應(yīng)動(dòng)物中的DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。MET1能維持重復(fù)和單拷貝DNA序列中CG類型的甲基化,并影響形態(tài)特征、花期調(diào)控和移植變化;DRM包括DRM1、DRM2和Zmet3,對(duì)非對(duì)稱位點(diǎn)的DNA序列進(jìn)行從頭甲基化,維持失活轉(zhuǎn)座子及轉(zhuǎn)基因沉默位點(diǎn)的胞嘧啶甲基化,同時(shí)也能對(duì)與siRNA同源的序列中的胞嘧啶進(jìn)行從頭甲基化;CMT主要維持CHG和CHH核苷酸序列中胞嘧啶的甲基化,同時(shí)也能對(duì)與siRNA同源的序列的胞嘧啶進(jìn)行從頭甲基化;此外,還有通過(guò)MET1維持CG甲基化的HDA6、通過(guò)CMT3維持非CG甲基化的SUV家族、從頭進(jìn)行DNA甲基化的NRPD1b等其他甲基化酶。研究表明,MET1、DRM和CMT基因突變后可以引起擬南芥(Arabidopsisthaliana)整個(gè)基因組或部分基因DNA甲基化水平發(fā)生改變[15~17]。DNA去甲基化酶基因中含有最保守的DNA糖苷酶結(jié)構(gòu)域。在植物中,DNA糖苷酶結(jié)構(gòu)域是一種雙功能團(tuán):一方面直接剪切甲基胞苷,另一方面能在脫堿基位點(diǎn)裂開(kāi)DNA主鏈;然后通過(guò)DNA堿基的切除修復(fù)途徑(DNA聚合酶和連接酶)用無(wú)修飾的胞苷填補(bǔ)堿基空位。DNA糖苷酶有兩種:一種只是水解堿基和脫氧核糖之間的糖苷鍵,另一種不僅水解堿基和脫氧核糖之間的糖苷鍵,并且具有脫嘌呤嘧啶內(nèi)切核酸酶的作用,裂解DNA主鏈的無(wú)堿基位點(diǎn)。DNA去甲基化酶基因主要有4個(gè)家族:DME、ROS1、DML2和DML3。只存在于雙子葉植物中的DME,通常在雌配子體的中央細(xì)胞和助細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá),從而影響胚和胚乳的發(fā)育,而ROS1在植物的所有組織中都有表達(dá),它能抑制基因啟動(dòng)子的甲基化。如水稻(Oryzasativa)中的ROS1b(DNG701)基因的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Tos17的甲基化水平,進(jìn)而改變其轉(zhuǎn)座活性。DML2和DML3主要是抑制植物營(yíng)養(yǎng)組織中特定位點(diǎn)的DNA甲基化。對(duì)DNA糖苷酶的結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行分析顯示,ROS1是雙功能團(tuán)的DNA糖苷裂解酶,而DME為單功能團(tuán)糖苷酶,但有研究也表明DME、DML2、DML3和ROS1一樣是雙功能團(tuán)的DNA糖苷裂解酶[26~28]。在植物生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答過(guò)程中,DNA去甲基化能夠激活一些特殊基因的功能以及對(duì)基因組后生狀態(tài)進(jìn)行重置,分為被動(dòng)去甲基化和主動(dòng)去甲基化。在DNA復(fù)制時(shí),DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的失活會(huì)導(dǎo)致DNA被動(dòng)去甲基化;而與DNA復(fù)制無(wú)關(guān)的DNA主動(dòng)去甲基化則需要DNA去甲基化酶參與,并且在DNA主動(dòng)去甲基化中占主導(dǎo)地位。DNA主動(dòng)去甲基化可以阻止內(nèi)外源基因的轉(zhuǎn)錄沉默,調(diào)節(jié)印跡基因和轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄。ROS1介導(dǎo)的DNA主動(dòng)去甲基化可引起5SrDNA染色質(zhì)的解凝,以及引起植物對(duì)生物脅迫和環(huán)境脅迫的響應(yīng)[34~36];另外,還可以阻止RNA介導(dǎo)的DNA甲基化。DRM2通過(guò)siRNA的裝載可以對(duì)整個(gè)序列上的胞嘧啶(CG、CHG和CHH)進(jìn)行甲基化,從而促使含有同源DNA序列的基因轉(zhuǎn)錄沉默[37~40]。已有的研究表明,當(dāng)基因的啟動(dòng)子能夠生成24nt的siRNA時(shí),該基因就能被RNA介導(dǎo)的DNA甲基化所沉默。DNA去甲基化酶在DNA主動(dòng)去甲基化中起到重要作用。迄今為止,植物DNA去甲基化酶基因的功能研究主要集中在水稻和擬南芥中,然而對(duì)于其在不同物種中的進(jìn)化與線性同源關(guān)系還不太清楚,這在一定程度上限制了對(duì)該基因家族的有效利用。本文選取已知的10個(gè)DNA去甲基化酶基因?yàn)閰⒄?通過(guò)序列比對(duì)從水稻、高粱(Sorghumbicolor)、擬南芥、毛果楊(Populustrichocarpa)基因組中分別獲得8、6、7、6個(gè)同源基因,絕大部分基因在染色體上的位置是線性同源的;同時(shí)基于糖苷酶保守區(qū)域的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),探究DNA去甲基化酶基因在高等植物中的進(jìn)化關(guān)系;水稻和擬南芥中的基因表達(dá)分析表明,基因的組織特異性表達(dá)與進(jìn)化密切相關(guān)。該研究有助于進(jìn)一步研究DNA的主動(dòng)去甲基化以及DNA去甲基化酶基因表觀調(diào)控的有效利用。1材料和方法1.1dna去甲基化酶基因雙子葉植物擬南芥中有4個(gè)DNA去甲基化酶基因:ROS1、DME、DML2和DML3;而單子葉植物水稻中有6個(gè)DNA去甲基化酶基因:ROS1a、ROS1b、ROS1c、ROS1d、DML3a和DML3b。以水稻、擬南芥中的這10條基因的氨基酸序列為參考,以E<e-51.2糖苷酶保守區(qū)域氨基酸序列的獲取以DNA去甲基化酶基因中最保守的糖苷酶結(jié)構(gòu)域?yàn)閷?duì)象,利用WebLogo3軟件(/create.cgi)獲得糖苷酶保守區(qū)域氨基酸序列的Logo圖。同時(shí)使用ClustalX軟件進(jìn)行多序列聯(lián)配,并用MEGA5.05構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),構(gòu)建方法選用最大似然法,采用最佳的WAG模型,Bootstrap值設(shè)為1000。1.3全民主義基因同源片段的獲得以所有鑒定出的DNA去甲基化酶基因?yàn)閰⒄?分別選取其上、下游的基因,在水稻、高粱、擬南芥、毛果楊基因組中尋找同源基因,獲得對(duì)應(yīng)的染色體同源區(qū)段。1.4水稻和擬南甲基化酶的發(fā)現(xiàn),用微陣列分析工具M(jìn)eV軟件(MultiExperimentViewer)得到基因表達(dá)的熱圖(heat-map)。2結(jié)果與分析2.1dna去甲基化酶基因本研究以擬南芥和水稻中已知的10個(gè)DNA去甲基化酶基因的氨基酸序列為參照,在水稻、高粱、擬南芥和毛果楊中分別找到8、6、7、6個(gè)DNA去甲基化酶同源基因(表1)。在水稻中新鑒定出2個(gè)基因Os06g13070和Os11g16580;在擬南芥中新鑒定出3個(gè)基因AT1G05900、AT2G31450和AT3G47830。DNA去甲基化酶基因的數(shù)目在4個(gè)物種中相差不大(僅0~2個(gè)),表明控制植物DNA主動(dòng)去甲基化的基因數(shù)目相仿。然而DNA去甲基化酶基因的氨基酸殘基長(zhǎng)度卻有顯著差異,短序列變幅在277~386個(gè)氨基酸,長(zhǎng)序列為901~1987氨基酸。在水稻、高粱、擬南芥和毛果楊4個(gè)物種中DNA去甲基化酶基因以長(zhǎng)序列居多,但其短和長(zhǎng)的比例并不相同,分別為3:5、1:5、2:5和2:4。DNA去甲基化酶基因多數(shù)分布在不同的染色體上,具有隨機(jī)性。如擬南芥中的5對(duì)染色體上均有DNA去甲基化酶分布,水稻中DNA去甲基化酶多數(shù)位于較長(zhǎng)染色體(1、2、4、5、6)上,高粱中則多數(shù)分布于較短染色體(6、8、9、10)上,而毛果楊中多分布在19對(duì)染色體的中等長(zhǎng)度染色體(6、7、8、10)上。DNA去甲基化酶基因在染色體上的分布見(jiàn)表1。2.2高等植物中dna去甲基化酶基因的進(jìn)化氨基酸序列是酶的一級(jí)結(jié)構(gòu),相對(duì)于堿基序列更能反映不同DNA去甲基化酶基因間的關(guān)系。鑒于DNA去甲基化酶基因全長(zhǎng)序列在不同物種或同一物種不同家族中差異較大,不適合做進(jìn)化分析。因此,本研究選擇其最保守的糖苷酶結(jié)構(gòu)域149個(gè)氨基酸加以分析(圖1)。結(jié)果表明,該結(jié)構(gòu)域由8個(gè)螺旋區(qū)(1-9、15-20、28-33、39-50、59-68、84-95、119-130、138-149)組成,而且發(fā)現(xiàn)有6個(gè)氨基酸非常保守,它們是賴氨酸(K,40位)、天冬氨酸(D,59位)和半胱氨酸(C,133位、140位、143位、149位)(圖1)。為揭示高等植物中DNA去甲基化酶基因的進(jìn)化關(guān)系,本研究采用最大似然法構(gòu)建DNA去甲基化酶基因的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。所有的基因分為4個(gè)亞家族:ROS1,DML3,DML4和DML5,其中ROS1和DML3亞家族中含有已知的10個(gè)基因,而DML4和DML5亞家族中是新鑒定的基因(圖2A)。本文發(fā)現(xiàn)在ROS1亞家族中,單子葉植物的ROS1基因都聚集在一起,而雙子葉植物的ROS1則和DME基因聚集在一起。對(duì)該組基因全長(zhǎng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)雙子葉植物中的DME與ROS1基因的同源性高于與單子葉植物ROS1基因的同源性(圖2B),推測(cè)雙子葉植物的DME基因是從ROS1基因復(fù)制過(guò)來(lái)的,并且與單子葉植物的ROS1基因?qū)偻椿颉Ｔ趩巍㈦p子葉植物分化之后,單子葉植物內(nèi)部ROS1基因還繼續(xù)復(fù)制產(chǎn)生新的ROS1基因,甚至水稻和高粱從共同祖先分化之后,水稻中的ROS1基因仍在復(fù)制(ROS1a和ROS1b)。在DML3亞家族中所有的DML3基因聚在一起,通過(guò)全長(zhǎng)序列分析進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果(圖3C),但擬南芥的DML2與ROS1同源性高于與DML3基因之間的同源性,推測(cè)DML2與ROS可能是同源基因。而在新鑒定的DML4和DML5亞家族中4個(gè)物種都有相應(yīng)的同源基因(圖3A),表明此兩類亞家族基因很保守,為此,根據(jù)序列的同源性分別將其命名為DML4和DML5(表1)。2.3醇溶蛋白基因與dna的同源關(guān)系為了驗(yàn)證在系統(tǒng)進(jìn)化分析中結(jié)果的可靠性,本研究對(duì)所有的DNA去甲基化酶基因在基因組位置上的共線性進(jìn)行分析。水稻中的Os05g37350(ROS1b和Os05g37410(ROS1c)是串聯(lián)復(fù)制基因,這兩個(gè)基因和高粱的Sb09g021920(ROS1b)是線性同源基因;水稻Os02g29230(ROS1d)與高粱的Sb04g019820(ROS1d)是同源基因;然而在高粱中卻找不到Os01g11900(ROS1a)的線性同源基因,推測(cè)該基因可能被缺失或者在水稻中獲得新復(fù)制的Os01g11900(ROS1a)基因;同時(shí)高粱中多了Sb08g008620(ROS1e),從系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果可以推斷該基因可能是從Sb04g019820(ROS1d)基因復(fù)制得到的(圖2,圖3A)。本研究發(fā)現(xiàn),在雙子葉植物中,擬南芥的DME基因(At5G04560)與毛果楊的DME基因(DMEa,Potri.008G025900和DMEb,Potri.010G234400)是線性同源基因(圖3A);而擬南芥的At3G10010(DML2)基因與At2G36490(ROS1)和Potri.006G116000(ROS1)線性同源(圖3A),暗示毛果楊的DMEa和DMEb以及擬南芥的DML2與ROS1是由染色體復(fù)制或者是全基因組復(fù)制所產(chǎn)生的,隨后經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期復(fù)雜的進(jìn)化,At3G1001(DML2)和At2G36490(ROS1)在結(jié)構(gòu)和功能上會(huì)發(fā)生變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)DME與ROS1以及DML2位點(diǎn)之間存在同源關(guān)系,表明擬南芥和毛果楊分化之前發(fā)生過(guò)一次全基因組復(fù)制,這與之前的研究結(jié)果相一致。在DML3亞家族中5個(gè)DML3同源基因Os02g29380(DML3a)、Os04g28860(DML3b)、AT4G34060(DML3)、Potri.001G150000(DML3)和Sb06g029335(DML3)之間不存在線性同源關(guān)系(圖3B),推測(cè)這是因?yàn)镈NA去甲基化酶DML3基因家族在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷多次基因復(fù)制和丟失事件,在葉綠體基因組進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生過(guò)類似情況。在禾本科醇溶蛋白基因家族進(jìn)化過(guò)程中,不同亞科物種間的醇溶蛋白基因不存在線性同源關(guān)系,是獨(dú)立進(jìn)行遺傳。DNA去甲基化酶基因DML3亞家族不但在單、雙子葉植物物種間存在獨(dú)立遺傳,而且在單子葉植物內(nèi)部不同亞科間也是獨(dú)立遺傳。但是,在DML4和DML5亞家族中新鑒定的DNA去甲基化酶基因卻有著非常保守的線性同源關(guān)系(圖3:C,D)。2.4dna去甲基化酶基因表達(dá)為進(jìn)一步理解DNA去甲基化酶基因的表達(dá)模式和水平,本研究對(duì)水稻的RNA高通量測(cè)序結(jié)果和擬南芥的芯片結(jié)果進(jìn)行了分析。在水稻的不同發(fā)育階段,11種組織中DNA去甲基化酶基因的表達(dá)量差異明顯,Os02g29380(DML3a)、Os11g16580(DML5)和Os01g11900(Ros1a)的表達(dá)量都較高,而Os01g28860(DML3b)、Os02g29230(Ros1d)都較低(圖4A)。大多數(shù)DNA去甲基化酶基因在雌蕊、花序和胚中的表達(dá)要明顯高于其他組織,只有2個(gè)基因DML3b和Ros1d的表達(dá)量較低。可見(jiàn)DNA去甲基化酶基因的表達(dá)具有組織特異性。另外,與其他組織相比,DNA去甲基化酶基因在水稻胚乳中的表達(dá)量較低,這與胚乳的DNA甲基化水平低于其他組織相吻合,推測(cè)胚乳中的DNA去甲基化酶基因主要參與DNA的被動(dòng)去甲基化。DNA去甲基化酶基因還具有時(shí)空表達(dá)的特異性。在擬南芥12個(gè)不同組織中的表達(dá)顯示,多數(shù)基因的表達(dá)量在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期隨著播種天數(shù)增加而升高(圖4B),進(jìn)入生殖生長(zhǎng)期后,在雄蕊和衰老葉片中表達(dá)量下降(圖4:C,D)。然而,At5G04560(DME)和At1G05900(DML5b)在所有組織中的表達(dá)均相對(duì)較低。3dna去甲基化酶基因DNA去甲基化酶基因普遍存在于植物基因組中,本研究結(jié)果顯示在單子葉、雙子葉植物分化之前至少存在4個(gè)DNA去甲基化酶(類似)基因(Ros1、DML3、DML4和DML5),其中新鑒定的2個(gè)基因(DML4和DML5)在單、雙子葉植物中非常保守(圖2A,圖3:C,D),表達(dá)量也較高(圖4:A,B),表明它們具有重要的潛在功能,有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在物種的進(jìn)化過(guò)程中,DNA去甲基化酶基因家族存在著串聯(lián)復(fù)制、局部復(fù)制和全基因組復(fù)制等3種復(fù)制形式(圖3)。同時(shí)在ROS和DML3組中發(fā)生過(guò)基因丟失,特別是DML3,然而與禾本科中的醇溶蛋白基因家族類似,在該基因丟失之前復(fù)制了同源基因(圖3B)。擬南芥ROS家族中的Ros1、DML2和DME基因是全基因組復(fù)制所產(chǎn)生的同源基因,然而由于基因突變使得3個(gè)基因的功能都發(fā)生了變化,這是由于物種進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生基因無(wú)功能化、新功能化和亞功能化所致,也說(shuō)明DNA去甲基化酶基因在進(jìn)化過(guò)程中會(huì)更加傾向趨異進(jìn)化。不同的DNA甲基化酶基因通常會(huì)有不同的甲基化模式,DRM2調(diào)節(jié)CHH位點(diǎn)的甲基化,MET1調(diào)節(jié)CG位點(diǎn)的甲基化,CMT3調(diào)節(jié)CHG位點(diǎn)的甲基化,然而DNA去甲基化酶基因卻沒(méi)有這種作用模式,一些ROS1偏好CHG位點(diǎn),而另一些對(duì)胸腺嘧啶前的CG也有偏好性。DME基因從DNA上移除甲基胞苷,然后通過(guò)一個(gè)相關(guān)蛋白去甲基化,是基因組印記所必需的;Ros1通過(guò)去除基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化阻遏輸入基因和同源基因的