連錢草萃取物的制備及其抑菌活性研究

隨著社會主義現代化的推進，社會經濟發展水平不斷提高，人們對環境素質的要求也越來越高。植物起源和農藥的研究吸引了國內外學者的關注。近20年,我國植物源農藥的研制相當活躍,已生產和實際應用了40多種植物源殺蟲劑,100多家植物源農藥生產企業。植物是生物活性化合物的天然寶庫,其產生的次生代謝產物超過40萬種。研究表明,萬壽菊、丁香、地膚子、蒼耳、土木香等對植物病原菌均有一定的抑制作用。本實驗室研究表明,鴉膽子對甜菜夜蛾有較強的殺蟲活性,并首次在鴉膽子中分離鑒定了2個具有殺蟲活性的化合物。因此,對這些有生物活性的植物進行研究,不僅可以為植物源農藥的開發提供理論依據,還可以發現新的先導化合物,進行模擬合成,開發新型農藥。連錢草(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)別名活血丹、金錢草、遍地香。為唇形花科,活血丹屬。除西北、內蒙古外,全國各地均產。有研究表明,連錢草對金黃色葡萄球菌極度敏感,對痢疾桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌中度敏感。楊念云等從連錢草全草中分離并鑒定了10個黃酮類化合物。本文以蘋果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYamada.)、棉花立枯病菌(ThanatepephoruscucumerisDonk.)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.cucumerinum)和番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)為指示菌,測定了連錢草萃取物的生物活性,為其進一步的開發利用提供理論依據。1材料和方法1.1試驗植物材料1.2黃瓜衰落病原菌numoxsporuscucunum蘋果腐爛病菌(ValsamaliMiyabeetYama-da.)棉花立枯病菌(ThanatepephoruscucumerisDonk.)黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporiumf.cucu-merinum)番茄灰霉病菌(BotrytiscinereaPers.)由中國農業科學院植物保護研究所農藥毒理及天然產物化學研究組提供。1.3測試方法1.3.1包括千草乙醇提取、制備1.3.2毒力的回歸方程菌絲生長抑制率(%)=(對照菌落的直徑-處理菌落的直徑)/對照菌落的直徑×100式中菌落直徑(cm)=測量菌落直徑平均值-0.4利用DPS統計軟件對數據進行分析,計算毒力回歸方程及EC50。2結果與分析2.1不同萃取物對植物a表1結果表明:連錢草萃取物對4種植物病原真菌均有一定的抑制活性,其中氯仿萃取物對棉花立枯病菌的抑制作用最強,EC50為0.6193mg/mL。其次是番茄灰霉病菌和黃瓜枯萎病菌,EC50分別為1.5563mg/mL和1.6898mg/mL。而極性較小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物對4種植物病原真菌的抑制活性均較強,其中石油醚萃取物對4種植物病原真菌的EC50分別為:0.8373、3.5178、1.4960、2.3517mg/mL,氯仿萃取物對4種植物病原真菌的EC50分別為:0.6193、4.4586、1.6898、1.5563mg/mL。表2結果表明:對于棉花立枯病菌和番茄灰霉病菌,氯仿萃取物的抑制活性最強,EC50分別為0.6193mg/mL和1.5563mg/mL,其次是乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物。而對于蘋果腐爛病菌和黃瓜枯萎病菌,石油醚萃取物的抑制活性最強,EC50分別為3.5178mg/mL和1.4960mg/mL。綜合來看,連錢草萃取物中極性較小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物對4種植物病原真菌的抑制活性較強,根據相似相溶原理可知,連錢草中對4種植物病原真菌的生長起抑制作用成分的極性較小,因此有必要對連錢草中極性較小的萃取物進行進一步的分離。表1連錢草萃取物對4種植物病原真菌抑制活性的測定結果表2連錢草萃取物對4種植物病原真菌抑制活性大小比較結果3連錢草萃取物的抑制作用連錢草萃取物對4種植物病原真菌均有一定的抑制活性,且極性較小的石油醚萃取物、氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物對4種植物病原真菌的抑制活性較強,根據相似相溶原理可知,連錢草中對4種植物病原真菌的生長起抑制作用成分的極性較小,因此有必要對連錢草中極性較小的萃取物進行進一步的分離,確定其活性成分,為連錢草的進一步開發利用提供理論依據。而開展連錢草抑菌活性成分的研究,對發現高效、低毒、作用位點單一的農藥先導化合物也具有積極意義。從對植物病原真菌的抑制作用來看,連錢草萃取物對棉花立枯病菌的抑制作用最強,其次是黃瓜枯萎病菌和番茄灰霉病菌。在實驗結果的調查中發現,連錢草萃取物處理的蘋果腐爛病菌的菌落不同于多菌靈處理的蘋果腐爛病菌的菌落,推想連錢草萃取物對蘋果腐爛病菌的抑制作用機理可能與多菌靈對蘋果腐爛病菌的抑制作用機理不同,而兩者的抑制作用機理是否真正不同,還需要進行進一步的實驗驗證。連錢草(Glechomalongituba(Nakai)Kupr.)全株,購于河北省安國市新華中藥材有限責任公司。采用超聲波提取法:將連錢草經DGF2100型植物粉碎機粉碎,過40目篩,稱取3kg干粉,按料液比為1:6的比例,依次加入95%、80%、70%的乙醇,每次均在40℃,80Hz的條件下超聲30min,之后靜置24h,抽濾得濾液,將3次的濾液合并,用減壓旋轉蒸發器蒸發濃縮至膏狀,收集于棕色瓶中,置4℃冰箱中保存備用。采用液液分配萃取法:將連錢草乙醇提取物加入4倍量的水溶解。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行連續等量的萃取,減壓濃縮萃取液,分別得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物的浸膏,分別稱重后置4℃冰箱中保存備用。1.3.3生長抑制率測定參照陳年春的生長速率測定法:將各萃取物用6%的DMSO分別配成5、2.5、1.25、0.625、0.3125g/L5個濃度梯度,以培養皿中加入等量蒸餾水作為空白對照,以加入等量6%的DMSO作為溶劑對照,并設多菌靈(石家莊金田化工有限公司、80%WPCarbendazim)為陽性對照,在培養皿中加入帶藥培養基,待培養基凝固后,用滅過菌的內徑為4mm打孔器在培養好的病原菌上打孔取樣,得到直徑為4mm的菌餅,放入帶藥培養基的中央,每皿一個菌餅,