淺論家族性肌萎縮側索硬化癥研究中pGBKT7【摘要】目的構建能在酵母菌AH109中表達的mSOD1cDNA的穿梭表達質粒pGBKT7-mSOD1cDNA,研究突變SOD1編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用。方法通過PCR法以真核表達載pEGFP-mSOD1cDNA為模板，擴增獲得了120bp的mSOD1基因的末端及DNA結合域的片段，經過SalⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，基因重組的方法定向亞克隆于酵母雙雜交載體pGBKT7中，構建形成pGBKT7-mSOD1真核表達載體。結果經轉化，提取質粒雙酶切，核苷酸測序，BALST比對鑒定表明構建成功。結論成功構建穿梭質粒pGBKT7-mSOD1cDNA，為深入研究突變的SOD1基因編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用奠定了基礎。

【關鍵詞】酵母雙雜交載體亞克隆mSOD1cDNApGBKT7

Abstract:ObjectiveToConstructofpGBKT7mSOD1YeastTwoHybridExpressionVectorinstudyoffamilialamyotrophiclateralsclerosisandtostudyProteinproteininteractionsofmutationSOD1encodeprotein.MethodsWegotthemSOD1fragmentfrompEGFPmSOD1bypolymercasereaction(PCR).AfterdigestionbySalⅠandEcoRⅠ,mSOD1fragmentwassubcolonedintoYeastTwoHybirdexpressionvectorpGBKT7.ResultsAtlast,pGBKT7mSOD1YeastTwoHybridexpressionvectorwasconstructedandconfirmedbyRedigestion.ConclusionTheconstructionofpGBKT7mSOD1ishelpfultothestudyingofProteinproteininteractions.

Keywords:YeastTwoHybird;expressionVector;subclone;mSOD1CcDNA;pGBKT7

根據超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)含金屬的不同，可將其分為3種，分別為Cu,Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD，哺乳類動物體內，僅含有Cu,Zn-SOD與Mn-SOD。分布在胞漿中Cu,Zn-SOD，稱為SOD1；分布于線粒體中Mn-SOD，稱為SOD2；分布于胞外Cu,Zn-SOD稱為SOD3,其中SOD1是細胞中高水平表達的SOD，是SOD的主要形式［1］。研究小組在對一個肌萎縮側索硬化癥家系致病基因的研究中發現［2］，SOD1第二號外顯子出現突變，測序分析證實第2號外顯子編碼區插入了一個堿基A，第2外顯子的插入突變導致SOD1轉錄和翻譯時閱讀框改變，結果SOD1翻譯提前終止，研究小組把這108個堿基對的cDNA暫命名為mSOD1cDNA,提交GenBank，獲得的編號是EF143990。本文報告載體pGBKT7-mSOD1cDNA構建，為研究mSOD1基因突變編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用奠定了基礎。

1材料與方法

材料

主要試劑：限制性內切酶SalⅠ、EcoRⅠ、Taq聚合酶購自大連Takara公司。DNA連接試劑盒購自美國MBI公司，卡那霉素購自上海華美公司，質粒抽提試劑盒購自美國Promega公司。

菌株和質粒：pGBKT7購自美國BDClontech公司，pEGFP-mSOD1為本課題組提供，大腸桿菌DH5α為燒傷研究所提供。根據mSOD1cDNA的序列設計引物：pGBKT7-mSOD1-EcoRIsense5‘-gacGAATTCATGGCGACGAAG-3‘,pGBKT7-mSOD1-SalIantisense:5‘-gacGTCGACATGCTTCCC

CACACCTTCATCT-3‘，引物由上海生工生物科技有限公司合成。

儀器設備：臺式離心機(上海安亭科儀廠生產)，PCR儀(美國Bio-Rad公司生產)，電泳儀(美國Bio-Rad公司生產)，手提紫外燈(美國Upland公司生產)，凝膠成像儀系統GelDoc2000(美國Bio-Rad公司生產)

方法

PCR反應：以pEGFP-mSOD1cDNA為模板，無核酸酶去離子水μL，10×PCRbuffer(mg2+free)5μL,dNTP()4μL,Mgcl2(25mM)3μL,上游引物μL，下游引物μL,模板1μL,Taq酶(5u/μL)μL,總反應體系50μL。擴增條件：94℃預變性5min，緊跟30個循環，每一個循環94℃變性30s,55℃復性30s，72℃延伸30s,最后72℃延伸10min補齊末端。

PCR產物電泳及低熔點瓊脂糖凝膠回收和純化：取PCR反應物5μL經%瓊脂糖凝膠電泳，結果擴增出一條約120bp的片段。取余下的PCR產物45μL行%低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化120bp的mSOD1cDNA片段，再次5μL經%瓊脂糖凝膠電泳，并測序。

mSOD1酵母雙雜交表達載體pGBKT7-mSOD1cDNA構建：分別以EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切pGBKT7和mSOD1回收純化酶切片段及線性化載體，在T4DNA連接酶的作用下連接，連接產物轉化感受態細胞α,將pGBKT7-mSOD1cDNA轉化的細胞接種于卡那霉素選擇培養基上，37℃培養12～16h，挑出陽性菌落搖菌，采用小質粒提取試劑盒提取質粒，以EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定。

載體pGBKT7-mSOD1cDNA測序和BLAST比對。

2結果

mSOD1cDNA片段的擴增以含有mSOD1cDNA片段的真核表達載體pEGFP-mSOD1為模板，擴增mSOD1cDNA片段，長度120bp，如圖1所示。圖2為膠回收驗證回收效果，從電泳圖看膠回收效果滿意。

mSOD1PCR產物測序結果

mSOD1PCR產物測序的序列結果：

GAATTCatggcgacgaaggccgtgtgcgtgctgaagggcgacggcccagtgcagggcat

catcaatttcgagcagaaggaaagtaatggaccagatgaaggtgtggggaagcatGTCGAC

mSOD1PCR產物測序的序列(圖3，見封2)

測序圖各峰整齊，無重疊，該PCR產物測序結果滿意和可信。

mSOD1cDNA酵母雙雜交載體的亞克隆將經EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切的mSOD1cDNA與線性化的pGBKT7連接，轉化，提質粒，酶切結果如圖4、5。將構建的載體命名為pGBKT7-mSOD1cDNA。

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序和BLAST比對結果

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序序列結果：

CGAGCCGCCATCATGGAGGAGCAGAAGCTGATCTCAGAGG

AGGACCTGCATATGGCCATGGAGGCCGAATTCATGGCGAC

GAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAG

GGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAG

ATGAAGGTGTGGGGAAGCATGTCGACCTGCAGCGGCCGCA

TAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGA

GGGGTTTTTTGCGCGCTTGCAGCCAA

載體pGBKT7-mSOD1cDNA的測序結果圖譜：(圖6，見封2)

把mSOD1cDNA構建到載體pGBKT7上，測序圖峰值整齊，無重疊。

BLAST比對結果

經過BLAST比對mSOD1cDNA完全與pGBKT7相連。

3討論

酵母雙雜交技術是20世紀90年代興起的一種研究蛋白質-蛋白質相互作用的高新分子生物學技術［3］，依據真核轉錄因子的DNA域和活性域分離的特性將兩者分離，即將酵母的轉錄因子GAL4分為GAL4BD和GAL4AD。將擬研究的靶蛋自(prey)和釣餌蛋自(bait)分別與GAL4AD、GAL4BD結合形成融合蛋白，只有當靶蛋白與誘餌蛋白相互作用時，GAL4調控的報告基因才能表達，酵母才能在選擇性培養基中生長。該技術不僅用于驗證己知蛋白之間的相互作用,亦可以自酵母雙雜交庫中尋找與誘餌蛋白相結合的新的蛋白質，發現新基因。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是一種金屬酶，它可以使超氧陰離子O2-歧化為過氧化氫和分子氧，故在維持生物體內氧自由基的平衡方面起重要作用。研究表明,基于其細胞定位，認為SOD1主要參與防御外周質及來自外界環境中的超氧化物對機體的毒害［4-5］。

肌萎縮側索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一種以腦和脊髓中大的運動神經元變性為特征的神經系統變性疾病，5%～10%的患者有家族性。臨床表現為緩慢起病，進行性發展，逐漸出現四肢肌肉的無力、萎縮，伴錐體束征等。臨床治療非常困難。目前己肯定編碼銅、鋅超氧化物歧化酶(Cu/Znsuperoxidedismutase，Cu/ZnSOD)的SOD1基因突變可引起部分家族性ALS的發病［6］。SOD1基因突變類型多達100種以上［7］。為了進一步研究該家系的發病機理，本文利用PCR技術和分子克隆方法，把mSOD1cDNA的序列亞克隆到酵母雙雜交的表達載體pGBKT7中，目的是為下一步酵母雙雜交打下基礎，也是深入研究突變的SOD1編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用的關鍵步驟之一。

【參考文獻】

［1］FaraciFM,Didionprotectionsuperoxidedismutaseisformsinthevesselwall［J］.ArteriosclerThrombVascBiol，2004,24(1)：1367-1373.

［2］史樹貴，李露撕，陳康寧，等.一個肌萎縮側索硬化家系SOD1基因突變的發現［J］.中華醫學遺傳學雜志，2004,21(2)：149-152.

［3］NakamuraT,HamadaF,IshidateT，etal.Axin,aninhibitoroftheWntsignallingpathway,interactswithbeta-catenin,GSK-3betaandAPCandreducesthebeta-cateninlevel［J］.GenesCells,1998,3(6):395.

［4］NarasipuraSD,AuitJG,BehrMJ,etofCu,Znsuperoxidedismutase(SOD1)geneknock-outmutantofCrptococcusneogormans:roleinbiologyandvirulence［J］.MolMicrobiol，2003,47(6):168-1694.

［5］PiddingtoDL,FangFC,LaessigT,et,ZnsuperoxidedismutaseofMycobacteriumtuberculosiscontributestosurvivalinactivatedmacrophagesthataregenerationanoxidationburst［J］.InfectImmun，2001,69(8):4980-4987.

［6］RosenDR,SiddiqueT，PattersonD,etinCu/Znsuperoxidedismutasegene