本課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章外源基因的表達(dá)第七章基因操作的基本技術(shù)第八章植物基因工程及應(yīng)用第九章動(dòng)物基因工程及應(yīng)用第十章醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用10/5/20231歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！第九章動(dòng)物基因工程及應(yīng)用第一節(jié)動(dòng)物基因工程的基本概念第二節(jié)動(dòng)物基因基因轉(zhuǎn)移的方法第三節(jié)動(dòng)物基因工程應(yīng)用10/5/20232歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！引言20世紀(jì)70年代末至80年代初，借助于受精卵顯微注射和早期胚胎細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等手段，將功能基因引入高等動(dòng)物的染色體DNA上，實(shí)現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。

多利綿羊克隆的成功，意味著不僅可以將任何基因轉(zhuǎn)入包括人體在內(nèi)的任何細(xì)胞中，而且還能使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物像重組微生物那樣繁殖。10/5/20233歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！10/5/20234歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！第一節(jié)動(dòng)物基因工程的基本概念一、轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因生物

轉(zhuǎn)基因生物（GeneticalmodifiedOrgamism，GMO；TransgenicOrganism，TO）：含有轉(zhuǎn)基因并為其遺傳修飾了的動(dòng)植物發(fā)育為個(gè)體。

轉(zhuǎn)基因通常是指在基因操作過(guò)程中整合到動(dòng)植物受體細(xì)胞基因組中的外源基因。從八十年代初以來(lái)，動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已得到了長(zhǎng)足的進(jìn)展，轉(zhuǎn)基因鼠、綿羊。豬、兔、牛、雞等都已相繼獲得成功，人類(lèi)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前局限在體細(xì)胞的基因治療方面，具有遺傳特征修飾的轉(zhuǎn)基因人研究仍受到倫理學(xué)和法學(xué)的束縛，末能跨出第一步，但這并不意味著在技術(shù)上有不可逾越的障礙。10/5/20235歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！二、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基因原理（一）轉(zhuǎn)基因的效率

通常，動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移的起點(diǎn)是受精卵，終點(diǎn)是含有整合型外源基因的動(dòng)物子代。轉(zhuǎn)基因的總有效率為：陽(yáng)性動(dòng)物子代數(shù)/轉(zhuǎn)基因受精卵數(shù)

以轉(zhuǎn)基因小鼠為例：

注射外源基因后受精卵的存活率為86%

將受精卵植入受體鼠體內(nèi)后受精卵的存活率為25%

移植田鼠的懷孕率為80%

轉(zhuǎn)基因的整合率為24%

因此，轉(zhuǎn)基因的總有效率為：4%

另外，外源基因的大小也是轉(zhuǎn)基因效率的一個(gè)指標(biāo)，不同的基因轉(zhuǎn)移方法所轉(zhuǎn)入的允許范圍也不同，10/5/20236歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！一般的，顯微注射可達(dá)幾kb-250kb；酵母人工染色體（YAC)轉(zhuǎn)基因至胚胎干細(xì)胞可達(dá)670kb；病毒為載體可轉(zhuǎn)移的片段一般不超過(guò)20kb。

（二）轉(zhuǎn)基因的共抑制效應(yīng)（Co-suppression）

在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)特性常會(huì)出現(xiàn)許多出人意料又難以解釋的現(xiàn)象。其中最普遍的現(xiàn)象便是轉(zhuǎn)基因的失活，也稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因的沉默，這種現(xiàn)象在轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中均有發(fā)生。迄今為止，轉(zhuǎn)基因的失活現(xiàn)象在轉(zhuǎn)基因植物中研究得較深入。研究表明，轉(zhuǎn)基因的失活機(jī)制是轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因（同源基因）的共抑制效應(yīng)，即當(dāng)受體細(xì)胞基因組中含有轉(zhuǎn)基因的同源基因時(shí)，轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因的表達(dá)同時(shí)受到抑制.10/5/20237歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！I共抑制效應(yīng)的特征

i共抑制只發(fā)生在轉(zhuǎn)基因與同源基因之間，而不影響其它基因的表達(dá)。

ii轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因發(fā)生體內(nèi)重組后，共抑制效應(yīng)消失，基因表達(dá)恢復(fù)正常。

iii共抑制現(xiàn)象的發(fā)生與結(jié)構(gòu)編碼區(qū)有關(guān)，而與啟動(dòng)子的來(lái)源無(wú)關(guān)。

iv兩個(gè)相同的轉(zhuǎn)基因之間也發(fā)生共抑制效應(yīng)，這也許是轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物中單拷貝的轉(zhuǎn)基因通常具有最高表達(dá)率的原因。II共抑制效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制假說(shuō)

i轉(zhuǎn)基因與同源基因相互作用，形成某種后成狀態(tài)而影響兩者的表達(dá)10/5/20238歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！ii轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因因競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合核基質(zhì)，核包膜上轉(zhuǎn)錄翻譯必須的不擴(kuò)散元件而出現(xiàn)相互抑制。

iii兩者形成互為反義RNA，使之失活并快速降解。

iv由于外源基因的存在，mRNA大量積累，并激活某些未知酶素，導(dǎo)致mRNA降解。

III轉(zhuǎn)基因失活的可能原因：有時(shí)，轉(zhuǎn)基因單方面失活，其同源的內(nèi)源基因仍表達(dá)。

i轉(zhuǎn)基因被受體細(xì)胞識(shí)別為異己DNA，并將之甲基化修飾，使其失活。

ii轉(zhuǎn)基因整合在不合適的染色體部位，受局部區(qū)域的影響而不表達(dá)。

iii轉(zhuǎn)基因本身的結(jié)構(gòu)對(duì)其表達(dá)的影響因素，如調(diào)控元件，內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的存在與否等等。10/5/20239歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！第二節(jié)動(dòng)物基因基因轉(zhuǎn)移的方法一、動(dòng)物基因工程的載體

動(dòng)物基因工程的載體主要有以下幾種：

１.猿病毒（SV40）

雙鏈環(huán)狀DNA，5226bp10/5/202310歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！SV40的結(jié)構(gòu)10/5/202311歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！10/5/202312歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！2.腺病毒（Adenovirus）

線狀雙鏈DNA，36kb,包裝上限37.8kb,修飾后上限4kb。

3.牛痘病毒

185kb，操作困難,先以重組病毒感染細(xì)胞，使其大量表達(dá)T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動(dòng)子的細(xì)菌重組質(zhì)粒以脂質(zhì)體的方式導(dǎo)入細(xì)胞。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間預(yù)培養(yǎng)，外源基因即在T7RNA聚合酶作用下轉(zhuǎn)錄并翻譯出異源蛋白。

4.逆轉(zhuǎn)錄病毒

整合型單鏈RNA病毒，裝配大小8kb。感染后，由逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，形成雙鏈DNA，插入寄主基因組復(fù)制，轉(zhuǎn)錄成mRNA，裝配分泌到胞外，不造成宿主細(xì)胞死亡。10/5/202313歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！5.pBR322和BVP分子的穿梭載體

在動(dòng)物基因工程中，經(jīng)常使用啟動(dòng)子有以下幾種：

熱休克基因家族啟動(dòng)子pHS（熱休克因子誘導(dǎo)）

病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列啟動(dòng)子（糖皮質(zhì)激素）

金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子（重金屬誘導(dǎo)）二、基因轉(zhuǎn)移的方法

動(dòng)物基因轉(zhuǎn)化的方法主要有：物理轉(zhuǎn)化法，病毒介導(dǎo)法和工程胚胎干細(xì)胞法。常用的方法主要有以下幾種。

（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

I基本程序：

1)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA與質(zhì)粒DNA的異源DNA型克隆載體。10/5/202314歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！2)克隆基因重組異源DNA型載體，在大腸桿菌等原核受體細(xì)胞中篩選、鑒定重組體。

3)通過(guò)物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細(xì)胞系（通常是小鼠細(xì)胞系）

采用的方法包含：磷酸鈣沉淀法，DNA+磷酸緩沖+CaCL2電穿孔法，脂質(zhì)體包埋法

4)重組DNA分子轉(zhuǎn)錄出RNA重組分子，包裝細(xì)胞合成包裝蛋白包裝成熟顆粒。

5)收集逆轉(zhuǎn)錄重組病毒，感染8細(xì)胞階段的小鼠胚胎細(xì)胞。

6)利用標(biāo)記基因篩選整合型轉(zhuǎn)基因胚胎細(xì)胞。

7)移植入小鼠母體體內(nèi)。10/5/202315歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！II優(yōu)缺點(diǎn)：

1)優(yōu)點(diǎn)：能有效地將轉(zhuǎn)基因整合入受體細(xì)胞的基因組內(nèi)，單拷貝整合型；轉(zhuǎn)基因整合后能穩(wěn)定地遺傳；整合機(jī)制相應(yīng)明確，在TR區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，不會(huì)破壞轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)

2)缺點(diǎn)：載量較小一般只有8kb可能會(huì)因缺少必須的調(diào)控元件而影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)；盡管種系載體被設(shè)計(jì)為復(fù)制缺陷型的，但在包裝細(xì)胞的包裝過(guò)程中，若與整合型輔助表達(dá)基因組發(fā)生同源重組，就有可能組裝成野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，因此在構(gòu)建具有商業(yè)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，一般使用受到限制。操作繁瑣。10/5/202316歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！（二）DNA顯微注射法

I基本程序：

1)通過(guò)激素療法使田鼠超數(shù)排卵，48小時(shí)后再注射人絨毛膜促進(jìn)腺激素，這時(shí)田鼠便會(huì)超數(shù)排卵，一般情況下5-10個(gè)，超數(shù)排卵為35個(gè)。

2)與雌性小鼠交配，然后殺掉田鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵。

3)將經(jīng)純化的轉(zhuǎn)基因樣品迅速注射入受精卵中變大的雄性原核內(nèi)。

4)將25-40個(gè)注射轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入田鼠體內(nèi)。

5)受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代10/5/202317歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！6)從小鼠子代體內(nèi)提取DNA樣品，雜交鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位點(diǎn)。

7)子代小鼠間進(jìn)行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達(dá)

II優(yōu)缺點(diǎn)：

1)優(yōu)點(diǎn)：轉(zhuǎn)基因范圍廣，且可轉(zhuǎn)移較大DNA片段，可達(dá)數(shù)百kb；轉(zhuǎn)基因不含任何病毒基因組片段，絕對(duì)安全。

2)缺點(diǎn)：整合機(jī)制不明確，無(wú)規(guī)律隨機(jī)整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不表達(dá)；整合位點(diǎn)隨機(jī)會(huì)造成轉(zhuǎn)動(dòng)物基因組的重排、突變、易位缺失等。10/5/202318歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！三、工程胚胎干細(xì)胞法多效性胚胎干細(xì)胞（ES）：胚胎發(fā)育到卵泡階段的細(xì)胞能在培養(yǎng)基中體外擴(kuò)增，重新輸入到胚胎胚泡后，仍保留分化成其他細(xì)胞的能力。

在體外培養(yǎng)時(shí)，ES細(xì)胞能方便地承受轉(zhuǎn)基因操作而不影響其分化多效性，利用這個(gè)系統(tǒng)，一個(gè)功能轉(zhuǎn)基因可被整合在ES細(xì)胞基因組中的一個(gè)非必須基因的特異位點(diǎn)上，構(gòu)成工程化胚胎干細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選鑒定，體外增殖，最后輸回小鼠胚胎胚泡中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，在這種方法中，整合的隨機(jī)性可以避免。

絕大多數(shù)的ES細(xì)胞不能整合DNA，采用正負(fù)選擇方法可將整合在特異位點(diǎn)上的轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞選出，并在體外富集這種細(xì)胞。10/5/202319歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！

I轉(zhuǎn)基因選擇載體的構(gòu)建

轉(zhuǎn)基因選擇載體通常包括下列部分：

1)兩個(gè)同源DNA片段（HB1,HB2），它們與ES細(xì)胞中某一必需基因兩端同源，保證轉(zhuǎn)基因及標(biāo)記基因neor通過(guò)同源交換定向整合在ES的這一非必需基因內(nèi)部。

2)轉(zhuǎn)基因（TG），必須能賦予受體ES細(xì)胞新的功能。

3)新霉素抗性基因（neor）賦予受體細(xì)胞對(duì)G418的抗性

4)胸腺嘧啶激酶基因（tR1、tR2），來(lái)自單純瘡疹病毒基因組的I型II型不同基因。tR基因?qū)嵸|(zhì)上是自殺基因，其產(chǎn)物可將一種化合物（Gancyclovir，10/5/202320歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！GCV）轉(zhuǎn)化成對(duì)細(xì)胞毒性的化合物，殺死細(xì)胞。

II轉(zhuǎn)基因ES細(xì)胞的篩選

1)正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整合型ES細(xì)胞：通過(guò)物理方法將重組DNA分子導(dǎo)入ES細(xì)胞，在含有抗菌素G418的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)ES細(xì)胞。由于重組分子是復(fù)制缺陷型的，所以在子代ES細(xì)胞中，重組分子已經(jīng)轉(zhuǎn)化入ES細(xì)胞的基因組中。

2)負(fù)選擇法篩選出特異整合型ES細(xì)胞：如果非特異性整合發(fā)生，則兩個(gè)tR基因或其中一個(gè)基因很大可能與TG和neor一起整合，這時(shí)用GCV篩選，其表達(dá)產(chǎn)物將殺死非整合型ES細(xì)胞，而特異性整合是通過(guò)雙交叉同源交換實(shí)現(xiàn)的。因此兩個(gè)tR基因就被排除，顯示出GCV抗性，并生長(zhǎng)。10/5/202321歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！3)PCR法鑒定整合型ES細(xì)胞：制備ES細(xì)胞染色體DNA，設(shè)計(jì)PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定外源基因是否在受體細(xì)胞中存在。

P1：與neor基因同源（動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)不存在neor基因）

P2：與ES細(xì)胞染色體HB1基因左邊外圍鄰近區(qū)域同源（CS區(qū)）

不幸的是ES的多效性并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)在：牛、羊、豬、雞中。10/5/202322歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！第三節(jié)動(dòng)物基因工程應(yīng)用動(dòng)物基因工程的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下三個(gè)方面：

a.研究基因的表達(dá)與功能

b.改良物種（牛、鼠、羊、豬、雞、魚(yú)）

c.作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白，主要是醫(yī)藥。在人類(lèi)中，基因工程的主要用途是基因治療。

一、利用動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因的表達(dá)與功能

轉(zhuǎn)基因進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞后，如果受體細(xì)胞基因組上也有存在著同源伙伴，那么轉(zhuǎn)基因的功能研究就會(huì)受到限制。在微生物中，通常是通過(guò)突變體研究基因的功能。但在動(dòng)物細(xì)胞中，由于大量?jī)?nèi)含子及非編碼順序的存在，降低了突變頻率。因此大都采用內(nèi)源基因定向滅活的方法。10/5/202323歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因研究中的應(yīng)用，大致有三種情況：

a.同源重組滅活細(xì)胞內(nèi)源基因

轉(zhuǎn)基因進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)后，通常會(huì)發(fā)生隨機(jī)整合，這不能滅活內(nèi)源同源基因。但當(dāng)轉(zhuǎn)基因與細(xì)胞內(nèi)基因組中某區(qū)域具有高度同源性時(shí)，轉(zhuǎn)基因便能準(zhǔn)確地與基因組中的同源重組。但在高等哺乳類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)則十分罕見(jiàn)，其同源重組頻率只及隨機(jī)整合的千分之一。然而，如果在轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)中，攜帶一個(gè)靈敏的標(biāo)記基因，便能有效地區(qū)分同源重組與隨機(jī)整合，篩選出所期望的細(xì)胞株，并將之輸回雌性動(dòng)物的胚胎中。在其子代體內(nèi)觀察轉(zhuǎn)基因的表型。

b.反義RNA或反義DNA抑制內(nèi)源基因表達(dá)

這種戰(zhàn)略是通過(guò)抑制mRNA轉(zhuǎn)錄而關(guān)閉內(nèi)源基因，10/5/202324歡迎同學(xué)們聽(tīng)課！而不是滅活內(nèi)源基因本身，其方法有：

1）反義RNA體外合成：由mRNA作模板，細(xì)菌RNA聚合酶催化合成mRNA的反義RNA顯微注射進(jìn)入受體細(xì)胞，阻止細(xì)胞內(nèi)源基因的表達(dá)。

2）單鏈DNA體外合成：根據(jù)靶基因順序，體外設(shè)計(jì)并合成一小段DNA單鏈（反義DNA），它與靶基因mRNA5'端的翻譯起始區(qū)互補(bǔ)，并抑制其翻譯。然后將高濃度的單鏈反義DNA片段直接加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，由于這種反義DNA分子量小，細(xì)胞會(huì)以較低的頻率吸收。如果將這些反義DNA進(jìn)行一些化學(xué)修飾，那么共轉(zhuǎn)化效率和胞內(nèi)的穩(wěn)定性均會(huì)大幅度提高。

3）反義RNA的體內(nèi)表達(dá)載體構(gòu)建：構(gòu)建原