本課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章外源基因的表達第七章基因操作的基本技術(shù)第八章植物基因工程及應(yīng)用第九章動物基因工程及應(yīng)用第十章醫(yī)學(xué)基因工程及應(yīng)用10/5/20231歡迎同學(xué)們聽課！第九章動物基因工程及應(yīng)用第一節(jié)動物基因工程的基本概念第二節(jié)動物基因基因轉(zhuǎn)移的方法第三節(jié)動物基因工程應(yīng)用10/5/20232歡迎同學(xué)們聽課！引言20世紀70年代末至80年代初，借助于受精卵顯微注射和早期胚胎細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染等手段，將功能基因引入高等動物的染色體DNA上，實現(xiàn)了種系內(nèi)和種系間細胞的基因轉(zhuǎn)移。

多利綿羊克隆的成功，意味著不僅可以將任何基因轉(zhuǎn)入包括人體在內(nèi)的任何細胞中，而且還能使轉(zhuǎn)基因動物像重組微生物那樣繁殖。10/5/20233歡迎同學(xué)們聽課！10/5/20234歡迎同學(xué)們聽課！第一節(jié)動物基因工程的基本概念一、轉(zhuǎn)基因與轉(zhuǎn)基因生物

轉(zhuǎn)基因生物（GeneticalmodifiedOrgamism，GMO；TransgenicOrganism，TO）：含有轉(zhuǎn)基因并為其遺傳修飾了的動植物發(fā)育為個體。

轉(zhuǎn)基因通常是指在基因操作過程中整合到動植物受體細胞基因組中的外源基因。從八十年代初以來，動物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已得到了長足的進展，轉(zhuǎn)基因鼠、綿羊。豬、兔、牛、雞等都已相繼獲得成功，人類的轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前局限在體細胞的基因治療方面，具有遺傳特征修飾的轉(zhuǎn)基因人研究仍受到倫理學(xué)和法學(xué)的束縛，末能跨出第一步，但這并不意味著在技術(shù)上有不可逾越的障礙。10/5/20235歡迎同學(xué)們聽課！二、動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的基因原理（一）轉(zhuǎn)基因的效率

通常，動物基因轉(zhuǎn)移的起點是受精卵，終點是含有整合型外源基因的動物子代。轉(zhuǎn)基因的總有效率為：陽性動物子代數(shù)/轉(zhuǎn)基因受精卵數(shù)

以轉(zhuǎn)基因小鼠為例：

注射外源基因后受精卵的存活率為86%

將受精卵植入受體鼠體內(nèi)后受精卵的存活率為25%

移植田鼠的懷孕率為80%

轉(zhuǎn)基因的整合率為24%

因此，轉(zhuǎn)基因的總有效率為：4%

另外，外源基因的大小也是轉(zhuǎn)基因效率的一個指標，不同的基因轉(zhuǎn)移方法所轉(zhuǎn)入的允許范圍也不同，10/5/20236歡迎同學(xué)們聽課！一般的，顯微注射可達幾kb-250kb；酵母人工染色體（YAC)轉(zhuǎn)基因至胚胎干細胞可達670kb；病毒為載體可轉(zhuǎn)移的片段一般不超過20kb。

（二）轉(zhuǎn)基因的共抑制效應(yīng)（Co-suppression）

在轉(zhuǎn)基因動物的研究中，轉(zhuǎn)基因的表達特性常會出現(xiàn)許多出人意料又難以解釋的現(xiàn)象。其中最普遍的現(xiàn)象便是轉(zhuǎn)基因的失活，也稱為轉(zhuǎn)基因的沉默，這種現(xiàn)象在轉(zhuǎn)基因動植物中均有發(fā)生。迄今為止，轉(zhuǎn)基因的失活現(xiàn)象在轉(zhuǎn)基因植物中研究得較深入。研究表明，轉(zhuǎn)基因的失活機制是轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因（同源基因）的共抑制效應(yīng)，即當(dāng)受體細胞基因組中含有轉(zhuǎn)基因的同源基因時，轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因的表達同時受到抑制.10/5/20237歡迎同學(xué)們聽課！I共抑制效應(yīng)的特征

i共抑制只發(fā)生在轉(zhuǎn)基因與同源基因之間，而不影響其它基因的表達。

ii轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因發(fā)生體內(nèi)重組后，共抑制效應(yīng)消失，基因表達恢復(fù)正常。

iii共抑制現(xiàn)象的發(fā)生與結(jié)構(gòu)編碼區(qū)有關(guān)，而與啟動子的來源無關(guān)。

iv兩個相同的轉(zhuǎn)基因之間也發(fā)生共抑制效應(yīng)，這也許是轉(zhuǎn)基因動植物中單拷貝的轉(zhuǎn)基因通常具有最高表達率的原因。II共抑制效應(yīng)的產(chǎn)生機制假說

i轉(zhuǎn)基因與同源基因相互作用，形成某種后成狀態(tài)而影響兩者的表達10/5/20238歡迎同學(xué)們聽課！ii轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源基因因競爭性結(jié)合核基質(zhì)，核包膜上轉(zhuǎn)錄翻譯必須的不擴散元件而出現(xiàn)相互抑制。

iii兩者形成互為反義RNA，使之失活并快速降解。

iv由于外源基因的存在，mRNA大量積累，并激活某些未知酶素，導(dǎo)致mRNA降解。

III轉(zhuǎn)基因失活的可能原因：有時，轉(zhuǎn)基因單方面失活，其同源的內(nèi)源基因仍表達。

i轉(zhuǎn)基因被受體細胞識別為異己DNA，并將之甲基化修飾，使其失活。

ii轉(zhuǎn)基因整合在不合適的染色體部位，受局部區(qū)域的影響而不表達。

iii轉(zhuǎn)基因本身的結(jié)構(gòu)對其表達的影響因素，如調(diào)控元件，內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的存在與否等等。10/5/20239歡迎同學(xué)們聽課！第二節(jié)動物基因基因轉(zhuǎn)移的方法一、動物基因工程的載體

動物基因工程的載體主要有以下幾種：

１.猿病毒（SV40）

雙鏈環(huán)狀DNA，5226bp10/5/202310歡迎同學(xué)們聽課！SV40的結(jié)構(gòu)10/5/202311歡迎同學(xué)們聽課！10/5/202312歡迎同學(xué)們聽課！2.腺病毒（Adenovirus）

線狀雙鏈DNA，36kb,包裝上限37.8kb,修飾后上限4kb。

3.牛痘病毒

185kb，操作困難,先以重組病毒感染細胞，使其大量表達T7RNA聚合酶，然后再將含有外源基因和T7啟動子的細菌重組質(zhì)粒以脂質(zhì)體的方式導(dǎo)入細胞。經(jīng)過一段時間預(yù)培養(yǎng)，外源基因即在T7RNA聚合酶作用下轉(zhuǎn)錄并翻譯出異源蛋白。

4.逆轉(zhuǎn)錄病毒

整合型單鏈RNA病毒，裝配大小8kb。感染后，由逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，形成雙鏈DNA，插入寄主基因組復(fù)制，轉(zhuǎn)錄成mRNA，裝配分泌到胞外，不造成宿主細胞死亡。10/5/202313歡迎同學(xué)們聽課！5.pBR322和BVP分子的穿梭載體

在動物基因工程中，經(jīng)常使用啟動子有以下幾種：

熱休克基因家族啟動子pHS（熱休克因子誘導(dǎo)）

病毒長末端重復(fù)序列啟動子（糖皮質(zhì)激素）

金屬硫蛋白基因啟動子（重金屬誘導(dǎo)）二、基因轉(zhuǎn)移的方法

動物基因轉(zhuǎn)化的方法主要有：物理轉(zhuǎn)化法，病毒介導(dǎo)法和工程胚胎干細胞法。常用的方法主要有以下幾種。

（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法

I基本程序：

1)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA與質(zhì)粒DNA的異源DNA型克隆載體。10/5/202314歡迎同學(xué)們聽課！2)克隆基因重組異源DNA型載體，在大腸桿菌等原核受體細胞中篩選、鑒定重組體。

3)通過物理方法將重組DNA分子轉(zhuǎn)入包裝細胞系（通常是小鼠細胞系）

采用的方法包含：磷酸鈣沉淀法，DNA+磷酸緩沖+CaCL2電穿孔法，脂質(zhì)體包埋法

4)重組DNA分子轉(zhuǎn)錄出RNA重組分子，包裝細胞合成包裝蛋白包裝成熟顆粒。

5)收集逆轉(zhuǎn)錄重組病毒，感染8細胞階段的小鼠胚胎細胞。

6)利用標記基因篩選整合型轉(zhuǎn)基因胚胎細胞。

7)移植入小鼠母體體內(nèi)。10/5/202315歡迎同學(xué)們聽課！II優(yōu)缺點：

1)優(yōu)點：能有效地將轉(zhuǎn)基因整合入受體細胞的基因組內(nèi)，單拷貝整合型；轉(zhuǎn)基因整合后能穩(wěn)定地遺傳；整合機制相應(yīng)明確，在TR區(qū)域內(nèi)進行，不會破壞轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)

2)缺點：載量較小一般只有8kb可能會因缺少必須的調(diào)控元件而影響轉(zhuǎn)基因表達；盡管種系載體被設(shè)計為復(fù)制缺陷型的，但在包裝細胞的包裝過程中，若與整合型輔助表達基因組發(fā)生同源重組，就有可能組裝成野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，因此在構(gòu)建具有商業(yè)價值的轉(zhuǎn)基因動物時，一般使用受到限制。操作繁瑣。10/5/202316歡迎同學(xué)們聽課?。ǘ〥NA顯微注射法

I基本程序：

1)通過激素療法使田鼠超數(shù)排卵，48小時后再注射人絨毛膜促進腺激素，這時田鼠便會超數(shù)排卵，一般情況下5-10個，超數(shù)排卵為35個。

2)與雌性小鼠交配，然后殺掉田鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵。

3)將經(jīng)純化的轉(zhuǎn)基因樣品迅速注射入受精卵中變大的雄性原核內(nèi)。

4)將25-40個注射轉(zhuǎn)基因的受精卵移植入田鼠體內(nèi)。

5)受精卵發(fā)育成胚胎，并繁殖成轉(zhuǎn)基因小鼠子代10/5/202317歡迎同學(xué)們聽課！6)從小鼠子代體內(nèi)提取DNA樣品，雜交鑒定轉(zhuǎn)基因的整合與否及位點。

7)子代小鼠間進行再交配，繁殖，觀察轉(zhuǎn)基因是否遺傳及表達

II優(yōu)缺點：

1)優(yōu)點：轉(zhuǎn)基因范圍廣，且可轉(zhuǎn)移較大DNA片段，可達數(shù)百kb；轉(zhuǎn)基因不含任何病毒基因組片段，絕對安全。

2)缺點：整合機制不明確，無規(guī)律隨機整合，多拷貝整合導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因不表達；整合位點隨機會造成轉(zhuǎn)動物基因組的重排、突變、易位缺失等。10/5/202318歡迎同學(xué)們聽課！三、工程胚胎干細胞法多效性胚胎干細胞（ES）：胚胎發(fā)育到卵泡階段的細胞能在培養(yǎng)基中體外擴增，重新輸入到胚胎胚泡后，仍保留分化成其他細胞的能力。

在體外培養(yǎng)時，ES細胞能方便地承受轉(zhuǎn)基因操作而不影響其分化多效性，利用這個系統(tǒng)，一個功能轉(zhuǎn)基因可被整合在ES細胞基因組中的一個非必須基因的特異位點上，構(gòu)成工程化胚胎干細胞，經(jīng)過篩選鑒定，體外增殖，最后輸回小鼠胚胎胚泡中，形成轉(zhuǎn)基因動物，在這種方法中，整合的隨機性可以避免。

絕大多數(shù)的ES細胞不能整合DNA，采用正負選擇方法可將整合在特異位點上的轉(zhuǎn)基因ES細胞選出，并在體外富集這種細胞。10/5/202319歡迎同學(xué)們聽課！

I轉(zhuǎn)基因選擇載體的構(gòu)建

轉(zhuǎn)基因選擇載體通常包括下列部分：

1)兩個同源DNA片段（HB1,HB2），它們與ES細胞中某一必需基因兩端同源，保證轉(zhuǎn)基因及標記基因neor通過同源交換定向整合在ES的這一非必需基因內(nèi)部。

2)轉(zhuǎn)基因（TG），必須能賦予受體ES細胞新的功能。

3)新霉素抗性基因（neor）賦予受體細胞對G418的抗性

4)胸腺嘧啶激酶基因（tR1、tR2），來自單純瘡疹病毒基因組的I型II型不同基因。tR基因?qū)嵸|(zhì)上是自殺基因，其產(chǎn)物可將一種化合物（Gancyclovir，10/5/202320歡迎同學(xué)們聽課！GCV）轉(zhuǎn)化成對細胞毒性的化合物，殺死細胞。

II轉(zhuǎn)基因ES細胞的篩選

1)正選擇法篩選出轉(zhuǎn)基因整合型ES細胞：通過物理方法將重組DNA分子導(dǎo)入ES細胞，在含有抗菌素G418的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)ES細胞。由于重組分子是復(fù)制缺陷型的，所以在子代ES細胞中，重組分子已經(jīng)轉(zhuǎn)化入ES細胞的基因組中。

2)負選擇法篩選出特異整合型ES細胞：如果非特異性整合發(fā)生，則兩個tR基因或其中一個基因很大可能與TG和neor一起整合，這時用GCV篩選，其表達產(chǎn)物將殺死非整合型ES細胞，而特異性整合是通過雙交叉同源交換實現(xiàn)的。因此兩個tR基因就被排除，顯示出GCV抗性，并生長。10/5/202321歡迎同學(xué)們聽課！3)PCR法鑒定整合型ES細胞：制備ES細胞染色體DNA，設(shè)計PCR引物，進行PCR擴增，鑒定外源基因是否在受體細胞中存在。

P1：與neor基因同源（動物細胞內(nèi)不存在neor基因）

P2：與ES細胞染色體HB1基因左邊外圍鄰近區(qū)域同源（CS區(qū)）

不幸的是ES的多效性并沒有發(fā)現(xiàn)在：牛、羊、豬、雞中。10/5/202322歡迎同學(xué)們聽課！第三節(jié)動物基因工程應(yīng)用動物基因工程的應(yīng)用主要體現(xiàn)在以下三個方面：

a.研究基因的表達與功能

b.改良物種（牛、鼠、羊、豬、雞、魚）

c.作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白，主要是醫(yī)藥。在人類中，基因工程的主要用途是基因治療。

一、利用動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究基因的表達與功能

轉(zhuǎn)基因進入動物細胞后，如果受體細胞基因組上也有存在著同源伙伴，那么轉(zhuǎn)基因的功能研究就會受到限制。在微生物中，通常是通過突變體研究基因的功能。但在動物細胞中，由于大量內(nèi)含子及非編碼順序的存在，降低了突變頻率。因此大都采用內(nèi)源基因定向滅活的方法。10/5/202323歡迎同學(xué)們聽課！轉(zhuǎn)基因技術(shù)在基因研究中的應(yīng)用，大致有三種情況：

a.同源重組滅活細胞內(nèi)源基因

轉(zhuǎn)基因進入動物細胞內(nèi)后，通常會發(fā)生隨機整合，這不能滅活內(nèi)源同源基因。但當(dāng)轉(zhuǎn)基因與細胞內(nèi)基因組中某區(qū)域具有高度同源性時，轉(zhuǎn)基因便能準確地與基因組中的同源重組。但在高等哺乳類動物體內(nèi)則十分罕見，其同源重組頻率只及隨機整合的千分之一。然而，如果在轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)中，攜帶一個靈敏的標記基因，便能有效地區(qū)分同源重組與隨機整合，篩選出所期望的細胞株，并將之輸回雌性動物的胚胎中。在其子代體內(nèi)觀察轉(zhuǎn)基因的表型。

b.反義RNA或反義DNA抑制內(nèi)源基因表達

這種戰(zhàn)略是通過抑制mRNA轉(zhuǎn)錄而關(guān)閉內(nèi)源基因，10/5/202324歡迎同學(xué)們聽課！而不是滅活內(nèi)源基因本身，其方法有：

1）反義RNA體外合成：由mRNA作模板，細菌RNA聚合酶催化合成mRNA的反義RNA顯微注射進入受體細胞，阻止細胞內(nèi)源基因的表達。

2）單鏈DNA體外合成：根據(jù)靶基因順序，體外設(shè)計并合成一小段DNA單鏈（反義DNA），它與靶基因mRNA5'端的翻譯起始區(qū)互補，并抑制其翻譯。然后將高濃度的單鏈反義DNA片段直接加入細胞培養(yǎng)基中，由于這種反義DNA分子量小，細胞會以較低的頻率吸收。如果將這些反義DNA進行一些化學(xué)修飾，那么共轉(zhuǎn)化效率和胞內(nèi)的穩(wěn)定性均會大幅度提高。

3）反義RNA的體內(nèi)表達載體構(gòu)建：構(gòu)建原